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概述
1936年，瑞典生物學(xué)家T·O·卡斯珀松最先設(shè)計和使用顯微鏡光度術(shù)測量細(xì)胞中核酸對紫外光的吸收，從而在細(xì)胞原位間接測定了核酸的含量。
顯微鏡光度計
顯微鏡光度術(shù)所用顯微鏡光度計是以顯微鏡為主體，加上光度測量系統(tǒng)（測量光闌、光電倍增管和單色儀等）和電學(xué)系統(tǒng)所組成。測量光闌位于樣品中間像平面上，用于限定測定范圍。根據(jù)特殊目的所設(shè)計的這類儀器，因部件不同，被命名為顯微光度計、顯微分光光度計、顯微光密度計、細(xì)胞熒光光度計、掃描顯微干涉儀等。根據(jù)光與物體相互作用的性質(zhì)，顯微鏡光度術(shù)可分為吸收光度術(shù)、熒光光度術(shù)和反射光度術(shù)等。
顯微鏡吸收光度術(shù)
通過測定樣品的透光度測定樣品化學(xué)成分的技術(shù)。所用儀器的構(gòu)造見圖。選擇單色光照明（一般選吸收峰值的波長），首先測量通過樣品周簡單的顯微鏡光度計圖解圍空白區(qū)的光強度I0，再測量通過樣品的光強度1，這樣就可以得到樣品的透光度（T）（T=I/I0）。進而推算出樣品的吸光率（E）〔E=log（1/T）〕。根據(jù)朗伯-貝爾定律，E=K·C·d，此處C為樣品濃度，K為克分子消光系數(shù)，d為樣品厚度。又因為C=m/d·B，所以m=B·E/K，此處m為樣品的質(zhì)量，B為樣品的面積。所以通過測量透光度，再轉(zhuǎn)換為吸光率就可推算出樣品的化學(xué)成分。
分別用波長為260納米和280納米的紫外光照射，可測定細(xì)胞中的核酸和蛋白質(zhì)的含量。用波長為400~?700納米的可見光照明，可測定細(xì)胞中色素（葉綠素和血紅素）的含量。用與細(xì)胞中特殊成分結(jié)合的染料來染色，利用染料與細(xì)胞中成分呈化學(xué)計量關(guān)系，則可通過測定細(xì)胞中染料的透光度來測定細(xì)胞中某種成分的含量。表1列出常用的測定細(xì)胞內(nèi)一些化學(xué)成分的染色反應(yīng)。
由于細(xì)胞中成分分布不均勻，常造成吸收測量的分布誤差，可用一波長兩區(qū)域法、兩波長一區(qū)域法或掃描法校正這種誤差.掃描法可把測量面積減小到顯微鏡的分辨水平，在微小面積范圍中可視被測成分為近似均勻分布，對整個樣品進行全面積的逐點掃描后，把每個測點的化學(xué)成分加在一起，即可測得樣品總的化學(xué)成分和面積的數(shù)值。利用這種高分辨的掃描技術(shù)，結(jié)合一些形態(tài)學(xué)分析，可對某些酶的分布和活性進行定量研究，分析核型和染色體帶型。
顯微光密度術(shù)
用透射光測定底片的吸收率（也稱黑底）。適用于普通照相底片、顯微攝影底片，電鏡底片、X射線衍射底片、光譜線底片和放射自顯影底片等。樣品的吸收光譜采用固定測量區(qū)域，用單位儀的不同波長分別掃描樣品和空白區(qū)而測得。吸收光譜對于鑒別物質(zhì)和掌握顯微鏡吸收測量條件都很有用處。
顯微鏡熒光光度術(shù)
測定材料在熒光顯微鏡下所產(chǎn)生熒光像的熒光強度的技術(shù)。由于熒光是由熒光物質(zhì)直接產(chǎn)生，所以測量時沒有分布誤差、靈敏度高、且能利用不同的激發(fā)光測定一個樣品的多種熒光物質(zhì)，因而可對同一個細(xì)胞的多種成分如 DNA、RNA和蛋白質(zhì)進行相關(guān)測定。熒光強度的測定可用透射光或落射光照明，常用的是利用落射光明場照明的熒光照明器。
在落射光照明時，熒光物質(zhì)的濃度和熒光強度遵守以下公式:
F=I0Qrel（1-e-kCd）
式中F為熒光發(fā)射強度;I0為照明的落射光強度;Qrel為相對量子產(chǎn)額;K為熒光物質(zhì)的克分子消光系數(shù);C為熒光物質(zhì)的濃度;d為熒光物質(zhì)厚度。
只有在一定的條件下（落射光照明和熒光物質(zhì)低濃度時），熒光發(fā)射強度和熒光物質(zhì)濃度間是近似的線性關(guān)系。與吸收光度術(shù)不同，因受儀器因素的影響，顯微鏡熒光光度術(shù)所測的熒光強弱只是一個相對的數(shù)值。所以需要一種熒光標(biāo)準(zhǔn)（一般用鈾玻璃）來校正整個儀器狀態(tài)。還需要一種生物樣品作為內(nèi)插標(biāo)準(zhǔn)（如淋巴細(xì)胞），它與所測定的樣品同時染色和測量，以便于不同制備條件下的樣品之間能互相比較。
利用顯微熒光光度計可以測定:細(xì)胞中熒光物質(zhì)如脂褐素、葉綠素和血紅素的含量，免疫熒光的強度，神經(jīng)遞質(zhì)生物單胺的熒光強度。此外，通過測定酶作用后熒光底物所產(chǎn)生的熒光強度可以測定酶的含量和酶的動力學(xué)參數(shù)。利用特異的熒光染料（表2）和細(xì)胞的一定成分相結(jié)合，如果二者皇化學(xué)計量關(guān)系，則通過測量熒光染料的熒光強度，可以間接測得細(xì)胞成分的含量。
在物鏡和光電倍增管之間加上一個單色器，則可通過改變波長測定熒光發(fā)射光譜，用于鑒別組織和細(xì)胞中的熒光物質(zhì)，還可用于研究細(xì)胞中的能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。此外它也是掌握顯微熒光測量條件所必要的。
顯微熒光光度術(shù)的優(yōu)點是在測量熒光強度的同時，還能確定熒光物質(zhì)在組織及細(xì)胞中的部位。不足之處是測量時熒光容易消褪，還常有自發(fā)熒光和非特異性熒光的干擾，以至影響了測量的準(zhǔn)確性。70年代以來用光多道分析儀測量細(xì)胞的熒光發(fā)射譜（僅用32msec），可彌補這些缺點。
顯微鏡反射光度術(shù)
通過測量顯微自顯影銀粒反射光的強度來測量銀粒密度的技術(shù)。顯微放射自顯影中銀粒的數(shù)目與其反射光的測定數(shù)值呈線性關(guān)系，并且銀粒數(shù)目與被標(biāo)記的物質(zhì)含量也呈線性關(guān)系，因此通過對銀粒反射光的測定可推算出被標(biāo)記物質(zhì)的量。這比計數(shù)銀?？於覝?zhǔn)確，當(dāng)和顯微鏡熒光光度法同時利用時（如用熒光物質(zhì)標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)DNA），可以同時測出細(xì)胞中的銀粒和與銀粒重疊部位的熒光標(biāo)記的物質(zhì)含量（如細(xì)胞核內(nèi)DNA）。要滿足以上測量條件，應(yīng)使顯影的銀粒盡可能均勻，并且銀粒不要過密。測量銀粒反射光可用垂直暗場或垂直明場照明兩種方法。后者可以控制照明區(qū)域，在這種情況下可見到在暗背景中明亮的銀粒。
顯微鏡光度術(shù)還可用于測量不染色生物樣品的光程差，進而推算出物質(zhì)的厚度和濃度（或質(zhì)量）。
參考資料
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