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色譜介紹
（ion pairreversed phase chromatography ）
色譜應(yīng)用
反相離子對(duì)色譜法測(cè)定魚腥草素鈉的含量
儀器與試藥
1.1 儀器 美國(guó)HPll00高效液相色譜儀，VWD紫外一可見(jiàn)光檢測(cè)器，HPl 100化學(xué)工作站，Rheodyne手動(dòng)進(jìn)樣器，日本島津UV-265FW自動(dòng)記錄分光光度計(jì)，SB3200超聲波清洗器。
1.2 試劑 乙腈、甲醇均為色譜純，磷酸、醋酸、醋酸銨、四丁基氫氧化銨、四丁基溴化銨均為分析純，超純水。
1.3 對(duì)照品與樣品 魚腥草素鈉對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為:0247-9601）;魚腥草素鈉原料（上海漢殷藥業(yè)有限公司，批號(hào)為:990701，010301，030101，030301、040101）
2 測(cè)定方法與結(jié)果
2.1 色譜條件
色譜柱:Zorbax Cs 5μm，150 mn×4。6 mm;流動(dòng)相:2mmol/L四丁基氫氧化銨溶液.乙腈（64:36）;流速:1。0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):283 nm;柱溫為室溫;進(jìn)樣量為20 μL。
2.2 色譜條件選擇
2.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)及溶劑選擇 取魚腥草素鈉對(duì)照品，用流動(dòng)相超聲溶解并制成約8μg/mL的溶液，進(jìn)行紫外掃描。魚腥草素鈉能溶解并在283 nm處有最大吸收，故以此波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng)，流動(dòng)相為溶劑。
2.2.2 柱溫選擇 取同一樣品溶液，于同日分別在室溫（22℃）、柱溫為42℃下各進(jìn)樣兩針，結(jié)果魚腥草素鈉的理論塔板數(shù)依次為8 898、8 900、8 899、8 899，RSD為O.1%;峰面積依次為168 685、167 633、164 638、167 185，RSD為1.0%。說(shuō)明柱效幾乎不變，柱溫對(duì)檢測(cè)無(wú)影響，為避免加溫對(duì)色譜柱的損害，所以采用室溫作柱溫。
2。3 供試品溶液的制備
取干燥至恒重的魚腥草素鈉適量，精密稱定，加流動(dòng)相超聲溶解并稀釋成含魚腥草素鈉約為24 μg/mL的溶液，搖勻，即得。另取魚腥草素鈉對(duì)照品，同法制備對(duì)照品溶液。
2.4 方法學(xué)驗(yàn)證
2.4.1 線性關(guān)系考察 取魚腥草素鈉對(duì)照品，用流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1 mL含魚腥草素鈉O.080 1 mg的溶液，即為儲(chǔ)備液，精密取儲(chǔ)備液o.5，1.0，1.5，2.0，3.0，5.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻即得。吸取上述儲(chǔ)備液及稀釋溶液各20μL注入液相色譜儀，依法測(cè)定，每個(gè)濃度重復(fù)進(jìn)樣2次，記錄峰面積。分別以濃度C為橫坐標(biāo)，峰面積A的平均值為縱坐標(biāo)，求得魚腥草素鈉的線性回歸方程:A=1.289 5×10-2C+1.634 2×10-4，r=O。999 9;線性范圍為:80.1-1 602μg/mL。
2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取魚腥草素鈉對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀，記錄峰面積，RSD值為1.O%（幾=6）。
2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一樣品溶液于o，6，20，36，42，66h測(cè)定，記錄峰面積，魚腥草素鈉峰面積6次測(cè)定值的RSD為0.9%，表明樣品溶液在66 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品（030301）3份，依法測(cè)
定，平均含量為100。6%，RSD為1.3%。
2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的供試品5份，遞增添加魚腥草素鈉對(duì)照品溶液適量，依法制備和測(cè)定。魚腥草素鈉的平均回收率為99.6%，其RSD為1.0%。結(jié)果見(jiàn)表1。
3 樣品測(cè)定
取魚腥草素鈉原料5批，依法制備供試品溶液。分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液進(jìn)樣，用面積外標(biāo)法計(jì)算，并用碘量法測(cè)定進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)表2。
4 討論
4.1 檢測(cè)方法的選擇 魚腥草素鈉易溶于熱水，在水或乙醇中微溶，極性與對(duì)乙酰氨基酚相似，用其滴劑的反相檢測(cè)方法，以C18（5 I.Lm，4.6mm×150mill）為固定相，不同比例的甲醇.醋酸與醋酸銨緩沖液（pH6。o）為流動(dòng)相檢測(cè)，均無(wú)峰檢出。再將流動(dòng)相改為不同配比的磷酸.水.甲醇，三乙胺.水.甲醇試驗(yàn)，仍未果。
參考了青霉素的反相離子對(duì)色譜法檢測(cè)后，采用反相離子對(duì)色譜法，用短鏈固定相，C8（5 I.Lm，4.6 mm×150 mm）色譜柱，在流動(dòng)相中加入反離子試劑四丁基溴化銨，有峰檢出，但分離效果差;改加四丁基氫氧化銨，以2 mmol/L四丁基氫氧化銨溶液.甲醇（31:69）為流動(dòng)相試驗(yàn)，峰型有改善，可保留時(shí)間很短（約3。5 min）。將甲醇改為乙腈試驗(yàn)，效果良好。試驗(yàn)了不同配比，最終以2 mmol/L四丁基氫氧化銨溶液.乙腈（64:36）為流動(dòng)相，效果好。
4.2 反離子試劑的用量與流動(dòng)相的pH 流動(dòng)相中反離子試劑四丁基氫氧化銨的用量應(yīng)控制在1.6-2.2 mol/L。用量低于1.6 mol/L，由于親和力太低，起不到反離子效果;用量超過(guò)2.2 mol/L時(shí)，pH值過(guò)大，達(dá)9。O以上，易損壞色譜柱。經(jīng)試驗(yàn)，四丁基氫氧化銨的用量在2.0 mmol/L時(shí)，pH值為7.2，效果好。
反相離子對(duì)色譜法測(cè)定馬來(lái)酸噻嗎洛爾
1 儀器、藥品與試劑
島津LC-10AD泵，SPD-10A紫外檢測(cè)器，CTO-10A柱溫箱，C-R6A數(shù)據(jù)處理機(jī)。
馬來(lái)酸噻嗎洛爾（天津中央制藥廠），馬來(lái)酸噻嗎洛爾滴眼液（天津市售產(chǎn)品），輔料及中間產(chǎn)物（天津中央制藥廠）。
乙腈（色譜純），磷酸二氫鈉（化學(xué)純），辛烷磺酸鈉（山東禹王實(shí)業(yè)總公司化學(xué)試劑廠）。
2 色譜條件
色譜柱:YWG-C18（10 μm,4.6 mm×250 mm）;流動(dòng)相:0.065%辛烷磺酸鈉磷酸鹽緩沖液[取磷酸二氫鈉1.56 g，加水1000 mL,用磷酸（1→10）調(diào)節(jié)pH至3.50±0.05，加入辛烷磺酸鈉0.65 g使溶解，搖勻]-乙腈（70∶30）;流速:0.7 mL·min;檢測(cè)波長(zhǎng):297 nm;積分儀衰減:0;紙速:1.5 mm·min;靈敏度:0.05 AUFS;柱溫:40 ℃，理論板數(shù)不低于2 000。
3 實(shí)驗(yàn)方法
3.1 色譜條件的選擇 經(jīng)過(guò)對(duì)不同磷酸鹽、不同濃度（0.02，0.01，0.005 mol·L）緩沖溶液與甲醇或乙腈以不同配比（65∶35，70∶30，75∶25）篩選，并對(duì)加入不同離子對(duì)試劑（己烷磺酸鈉及辛烷磺酸鈉），比較其不同濃度（0.085%，0.065%，0.045%），不同pH條件（pH=3.0,pH=3.5）。最終選擇0.01 mol·L磷酸二氫鈉緩沖液[用磷酸（1→10）調(diào)pH=3.5]配制的0.065%辛烷磺酸鈉溶液與乙腈（70∶30）組成的流動(dòng)相為最佳條件。另以流動(dòng)相溶解原料作紫外掃描，最大吸收297 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。
3.2 線性實(shí)驗(yàn) 精密取馬來(lái)酸噻嗎洛爾適量（約相當(dāng)于噻嗎洛爾12.5 mg）置200 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度。分別精密取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL置25 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，進(jìn)樣20 μL,以濃度（μg·mL）為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，得到噻嗎洛爾的回歸方程:
Y=875.19X-137.05 r=0.999 3
結(jié)果表明濃度在3.0~11.2 μg·mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。
3.3 有關(guān)影響因素實(shí)驗(yàn) 取生產(chǎn)廠提供的馬來(lái)酸噻嗎洛爾中間體噻二唑、唑烷進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，均對(duì)主峰無(wú)影響。另按滴眼液處方配制空白輔料溶液，在規(guī)定的色譜條件下，基本為一直線，對(duì)本實(shí)驗(yàn)也無(wú)干擾。
3.4 精密度實(shí)驗(yàn) 精密稱取馬來(lái)酸噻嗎洛爾（980102批）適量（約相當(dāng)于噻嗎洛爾12.5 mg），置25 mL量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，重復(fù)進(jìn)樣6次，噻嗎洛爾RSD=0.35%,馬來(lái)酸RSD=0.44%，有較好的精密度。
3.5 加速實(shí)驗(yàn) 將原料藥980102批及滴眼液980502光照27 d后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。原料藥經(jīng)光照后比較穩(wěn)定，色譜圖無(wú)變化，滴眼液色譜圖有明顯改變，雜質(zhì)峰增多，含量下降。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，該方法能夠反映出樣品的變化，可以控制產(chǎn)品質(zhì)量。
4 樣品測(cè)定4.1 原料藥 取本品（約相當(dāng)于噻嗎洛爾12.5 mg），精密稱定，置25 mL量瓶中，加流動(dòng)相使溶解并稀釋至刻度，作為供試品溶液。精密取供試品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液。取對(duì)照溶液20 μL注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分色譜峰高約為記錄儀滿量程的10%~20%，再取供試品溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的3倍（主成分保留時(shí)間應(yīng)在10 min后），除馬來(lái)酸峰之外，供試品溶液的色譜圖如有雜質(zhì)峰，量取各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對(duì)照溶液的峰面積。結(jié)果見(jiàn)表3。
4.2 滴眼液 精密量取本品1 mL（約相當(dāng)于噻嗎洛爾5 mg）置10 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密量取1 mL置100 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度作為對(duì)照溶液，照上述方法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。
5 討論5.1 實(shí)驗(yàn)中流動(dòng)相比例的調(diào)整，以主峰保留時(shí)間在10 min之后為宜，馬來(lái)酸峰與相鄰雜質(zhì)峰基線分離較好。
5.2 方法中規(guī)定記錄色譜圖為主峰保留時(shí)間的3倍，是由于原料藥中間體噻二唑的保留時(shí)間約為26 min，實(shí)驗(yàn)中970601批滴眼液中檢出該雜峰。
5.3 本實(shí)驗(yàn)供試液自然放置24 h后復(fù)測(cè)，溶液濃度不變，雜質(zhì)量不增加，比較穩(wěn)定。
參考資料
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