近期，無限極（中國）有限公司與環(huán)特生物在期刊《中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報(bào)》上聯(lián)合發(fā)表題為 《復(fù)方中藥提取物增強(qiáng)免疫力作用及初步機(jī)制研究》的全新研究成果。該項(xiàng)目通過體外細(xì)胞和體內(nèi)斑馬魚實(shí)驗(yàn)，快速評價(jià)復(fù)方中藥提取物增強(qiáng)免疫力作用，并進(jìn)行了初步機(jī)制研究。

在體外實(shí)驗(yàn)中利用 RAW 264.7 小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞初步評價(jià)復(fù)方中藥提取物的生物活性；再以酒石酸長春瑞濱誘導(dǎo)建立斑馬魚活體免疫低下模型，分別從斑馬魚巨噬細(xì)胞生成和吞噬功能、T 細(xì)胞生成及相關(guān)炎癥、免疫基因的表達(dá)等多個(gè)方面，觀察復(fù)方中藥提取物的干預(yù)作用。

該研究顯示，體外實(shí)驗(yàn)中復(fù)方中藥提取物有良好的生物安全性，其在250μg/mL 條件下可提高酒石酸長春瑞濱誘導(dǎo)后的RAW264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞存活率。體內(nèi)研究表明，復(fù)方中藥提取物在222、667、2000 μg/mL 濃度時(shí)均可明顯改善長春瑞濱誘發(fā)的斑馬魚巨噬細(xì)胞數(shù)量的減少，同時(shí)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力；222、667μg/mL濃度可顯著增加 T 細(xì)胞熒光強(qiáng)度；222、667、2000μg/mL 濃度均可明顯恢復(fù)模型對照組中rag1、rag2基因相對表達(dá)量被下調(diào)的情況，并均可以顯著下調(diào)模型斑馬魚TNF-α基因相對表達(dá)量；復(fù)方中藥提取物222μg/mL可顯著上調(diào)免疫因子IL-12基因表達(dá)量，在2000μg/mL時(shí)顯著上調(diào) IFN-γ 基因表達(dá)量。

該研究基于體外細(xì)胞和體內(nèi)斑馬魚實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)方中藥提取物具有明顯的增強(qiáng)免疫力作用，為復(fù)方中藥提取物作為新的免疫保健食品和二次開發(fā)提供了指導(dǎo)性依據(jù)。

● 綜述

免疫力可以保護(hù)機(jī)體不受侵害，近年來，由于生態(tài)失衡所導(dǎo)致的免疫性疾病越來越多，西藥不能起到預(yù)防作用，治療效果不甚明顯且存在毒副作用。而中藥及其提取物在中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論指導(dǎo)下，擅治未病，講究協(xié)調(diào)和平衡，且毒副作用小，所以中藥及其提取物增強(qiáng)免疫力一直是新研究方向。

已有實(shí)驗(yàn)研究表明，靈芝多糖和生物堿均能明顯增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力和 T 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力，同時(shí)可提高小鼠外周血中 IFN-γ 的表達(dá)水平。五味子多糖、白術(shù)多糖及內(nèi)酯均具有抗氧化和增強(qiáng)機(jī)體免疫力活性；菟絲子提取物是有效的抗菌劑，抗氧化劑和抗炎劑；黨參和茯苓在多種急性和慢性炎癥的不同實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭酗@示抗炎活性。然而大部分研究都是以傳統(tǒng)的大小鼠為動物模型進(jìn)行評價(jià)，具有造模時(shí)間長、成本高、通量小等缺點(diǎn)。

斑馬魚（Danio rerio，zebrafish）是一種國際認(rèn)可的新型模式生物，其引人注目的優(yōu)勢是胚胎發(fā)育的透明性，基于高通量的檢測體系，以及短時(shí)-高效-低費(fèi)篩選。隨著“3R（reduction，replacement，refinement）原則”的推行與實(shí)施，其在藥物的靶點(diǎn)鑒別、疾病的模型開發(fā)和毒性評價(jià)中應(yīng)用越來越廣泛。

本研究采用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)斑馬魚免疫低下模型探究復(fù)方中藥提取物對免疫力的影響，從RAW 264.7 小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞活性，斑馬魚巨噬細(xì)胞數(shù)量及其吞噬功能，T 細(xì)胞數(shù)量，免疫相關(guān)基因水平多方面考察復(fù)方中藥提取物的生物安全性與增強(qiáng)免疫作用，對復(fù)方中藥提取物增強(qiáng)免疫功能進(jìn)行驗(yàn)證并提供理論依據(jù)。

● 項(xiàng)目研究結(jié)果

在體外實(shí)驗(yàn)中復(fù)方中藥提取物有良好的生物安全性，且可明顯提高酒石酸長春瑞濱誘導(dǎo)后小鼠單核巨噬細(xì)胞的存活率。

體內(nèi)研究表明，復(fù)方中藥提取物可明顯改善長春瑞濱誘發(fā)的斑馬魚巨噬細(xì)胞及 T 細(xì)胞數(shù)量的減少，同時(shí)增強(qiáng)體內(nèi)巨噬細(xì)胞的活性和吞噬能力；復(fù)方中藥提取物可明顯恢復(fù)模型對照組中rag1、rag2 基因相對表達(dá)量被下調(diào)的情況，復(fù)方中藥提取物上調(diào)免疫因子 IL-12 的表達(dá)量、IFN-γ 基因的相對表達(dá)量，復(fù)方中藥提取物可顯著下調(diào) TNF-α 基因相對表達(dá)量。

體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)表明復(fù)方中藥提取物具有明顯的增強(qiáng)免疫力作用。綜上所述，復(fù)方中藥提取物具有明顯的抗炎及增強(qiáng)免疫力的作用。本研究可為復(fù)方中藥提取物作為新的免疫保健食品和二次開發(fā)提供指導(dǎo)性依據(jù)。

● 相關(guān)實(shí)驗(yàn)

1. 復(fù)方中藥提取物對RAW264.7細(xì)胞存活率的影響

當(dāng)復(fù)方中藥提取物濃度為 62.5 ~ 250 μg/mL 時(shí)，RAW 264.7 細(xì)胞存活率均 > 90.0%；當(dāng)復(fù)方中藥提取物濃度為 500 μg/mL 時(shí)，RAW 264.7 細(xì)胞存活率下降為 84.0%。故確定復(fù)方中藥提取物對 RAW 264.7 細(xì)胞安全濃度為 250 μg/mL（見表 1）。

由表 2 可知，酒石酸長春瑞賓可導(dǎo)致 RAW 264.7 細(xì)胞存活率顯著下降；同時(shí)復(fù)方中藥提取物 3 倍濃度梯度干預(yù)后，細(xì)胞存活率呈劑量依賴性升高，復(fù)方中藥提取物 250 μg/mL 可顯著提高 RAW 264.7 細(xì)胞存活率（P< 0.01）。

2. 復(fù)方中藥提取物對斑馬魚的MTC

在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，復(fù)方中藥提取物62.5~2000μg/mL濃度組斑馬魚均未見明顯異常，各臟器和行為狀態(tài)與正常斑馬魚相似（見圖1）。提示復(fù)方中藥提取物對正常斑馬魚的 MTC為2000μg/mL。

3 復(fù)方中藥提取物對斑馬魚巨噬細(xì)胞生成的影響

由統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知（表3，圖2），酒石酸長春瑞賓可導(dǎo)致斑馬魚免疫力低下，表現(xiàn)為與正常對照組比較，酒石酸長春瑞賓組斑馬魚中巨噬細(xì)胞熒光強(qiáng)度顯著降低；復(fù)方中藥提取物低、中、高3倍濃度梯度干預(yù)后，巨噬細(xì)胞熒光強(qiáng)度均顯著升高，巨噬細(xì)胞減少的改善功效分別為18%（P<0.05）、21%（P<0.01）和 22%（P<0.01）。

4 復(fù)方中藥提取物對斑馬魚巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

由統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知（表4，圖3），與模型對照組比較，復(fù)方中藥提取物低、中、高3個(gè)濃度組均可明顯減少斑馬魚體內(nèi)熒光微球殘留數(shù)目（P< 0.05），表明復(fù)方中藥提取物具有促巨噬細(xì)胞吞噬功能作用。

5 復(fù)方中藥提取物對斑馬魚T細(xì)胞生成的影響

由統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知（表5，圖4），與正常對照組比較，模型對照組T細(xì)胞熒光強(qiáng)度極顯著降低，表明酒石酸長春瑞賓可誘導(dǎo)斑馬魚免疫抑制。與模型對照組比較，復(fù)方中藥提取物中濃度T細(xì)胞熒光強(qiáng)度顯著升高（P<0.01）；但高濃度對T細(xì)胞熒光強(qiáng)度無升高作用且呈現(xiàn)降低的作用趨勢。

6 復(fù)方中藥提取物對斑馬魚 T 細(xì)胞的影響及初步機(jī)制研究

6.1 RNA 濃度及純度

在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，提取斑馬魚總RNA，用超微量分光光度計(jì)測定RNA濃度及純度（A260/A280 比值），結(jié)果表明 A260/A280 比值均在1.88~2.03之間，表明提取得到斑馬魚總 RNA 質(zhì)量較好，可用于后續(xù)q-PCR實(shí)驗(yàn)（見表 6）。

6.2 對重組激活型基因rag1和rag2的影響

根據(jù)基因相對表達(dá)量公式計(jì)算，與正常對照組比較，模型對照組rag1、rag2基因相對表達(dá)量均顯著下調(diào)（P<0.01），復(fù)方中藥提取物干預(yù)后，低、中、高濃度組rag1、rag2基因相對表達(dá)量均顯著恢復(fù)（見表7）。

6.3 對免疫因子IL-12和IFN-γ的影響

與正常對照組比較，模型對照組IL-12基因相對表達(dá)量極顯著下調(diào)（P< 0.001），復(fù)方中藥提取物干預(yù)后，在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，低濃度組IL-12基因相對表達(dá)量極顯著上升（P< 0.001），中、高濃度組出現(xiàn)負(fù)反饋調(diào)節(jié)。

與正常對照組比較，模型對照組IFN-γ基因相對表達(dá)量顯著下調(diào)（P< 0.01），復(fù)方中藥提取物3倍濃度梯度干預(yù)后，IFN-γ基因相對表達(dá)量呈劑量依賴性恢復(fù)，復(fù)方中藥提取物高濃度組 IFN-γ 基因相對表達(dá)量極顯著上升（P< 0.001）（見表8）。

6.4 對致炎癥因子 TNF-α 的影響

模型對照組TNF-α基因相對表達(dá)量（1.000）與正常對照組（0.006）比較極顯著上調(diào)（P< 0.001）。復(fù)方中藥提取物低、中、高濃度組TNF-α基因相對表達(dá)量分別為 0.023、0.002 和 0.008（P<0.001），提示復(fù)方中藥提取物可顯著下調(diào)TNF-α基因相對表達(dá)量（見表9）。

● 討論

復(fù)方中藥提取物是靈芝、五味子、白術(shù)、菟絲子、茯苓和黨參提取物為主要原料，在之前的研究中，這六味中藥提取物均具有增強(qiáng)免疫力相關(guān)報(bào)道；此外，菟絲子、黨參和茯苓在多種急性和慢性炎癥模型中顯示強(qiáng)抗炎活性。

在本實(shí)驗(yàn)條件下，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中當(dāng)復(fù)方中藥提取物在62.5~250 μg/mL時(shí)，RAW264.7細(xì)胞存活率均>90.0%，表明復(fù)方中藥提取物具有良好的生物安全性，且在巨噬細(xì)胞的免疫作用方面，對于降低免疫力的造模劑來說，復(fù)方中藥提取物也有很好的改善作用，與對照組相比，細(xì)胞活性上升，這可能是因?yàn)閺?fù)方中藥提取物主要原料的安全性和促進(jìn)免疫力的作用。例如靈芝多糖可影響免疫細(xì)胞和免疫相關(guān)細(xì)胞，包括促進(jìn)B和T淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞活性。

復(fù)方中藥提取物同時(shí)在本次實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出較好的改善免疫力低下模型中巨噬細(xì)胞數(shù)量和吞噬能力，以及T細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，表明復(fù)方中藥提取物在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中能有效的增強(qiáng)機(jī)體免疫力，在之前的報(bào)道中，復(fù)方中藥提取物中具備的靈芝提取物可下調(diào)LPS誘導(dǎo)的促炎因子，并促進(jìn) BV-2 和原發(fā)性小膠質(zhì)細(xì)胞的抗炎細(xì)胞因子表達(dá)。

另外，靈芝提取物通過改變巨噬細(xì)胞吞噬作用從而達(dá)到先天免疫應(yīng)答的激活，對于基因表達(dá)水平方面，不同濃度的復(fù)方中藥提取物對免疫力低下模型抗炎因子水平的恢復(fù)，以及致炎因子水平的降低可以很好的從分子機(jī)制解釋復(fù)方中藥提取物的增強(qiáng)免疫力的原理，另外相當(dāng)多的研究對復(fù)方中藥提取物中的中藥成分免疫基因水平的表達(dá)給出了很好的解釋，例如五味子可通過增加衰老小鼠的血清IL-2，IL-4，IFN-γ，lgG，lgM 和lgA的水平，降低TNF-α和IL-6的含量，并增加白血球數(shù)量，吞噬活性，淋巴細(xì)胞增殖和體外脾臟指數(shù)去增強(qiáng)衰老小鼠的免疫力。

這些研究都為本實(shí)驗(yàn)提供了有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)的支撐，復(fù)方中藥提取物的增強(qiáng)免疫力功效也均與之報(bào)道相符合。