摘要：建立了一套利用反相液相色譜和大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析紅豆杉提取物中微量紫杉烷類化合物的方法。通過研究已知的10種紫杉烷類化合物的保留時(shí)間、質(zhì)譜特征，初步建立了一個(gè)紫杉烷類化合物的數(shù)據(jù)庫(kù)，利用這些數(shù)據(jù)可快速鑒定紅豆杉提取物中已知的紫杉烷類化合物，并能夠?qū)ξ粗衔镒鲆欢ǔ潭鹊慕Y(jié)構(gòu)分析。這種研究方法同樣對(duì)其他天然產(chǎn)物特別是微量成分結(jié)構(gòu)分析具有指導(dǎo)作用。
    關(guān)鍵詞：紫杉醇，大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜，紫杉烷類化合物
    引 言
    紫杉醇是zui早從短葉紅豆杉（Taxus brevifolia）莖皮中分離得到的一種二萜類化合物，用于治療頑固的卵巢癌和乳腺癌。然而紫杉醇資源有限，極大的限制了它的臨床應(yīng)用。在紫杉烷類化合物中，許多物質(zhì)都有抗腫瘤活性，還有一些可以通過結(jié)構(gòu)改造合成紫杉醇甚至藥效更好的化合物。無論是研究紅豆杉提取物中的紫杉烷類化合物還是結(jié)構(gòu)改造中的中間產(chǎn)物，都需要而靈敏的分離鑒定手段。液相色譜較早被用于紫杉烷類化合物的分離和紫杉醇的定量分析，質(zhì)譜也被廣泛的應(yīng)用于紫杉烷類化合物的分析鑒定。實(shí)驗(yàn)研究了紫杉烷類化合物的正離子大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜，找到了這些物質(zhì)的質(zhì)譜特征，并建立了利用反相液相色譜和大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究紅豆杉提取物中微量的紫杉烷類化合物的方法。
    2 實(shí)驗(yàn)部分
    2．1 試劑與儀器
    LCQ Advantage質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Finnigan公司）。乙腈為HPLC純；水由法國(guó)Millipore公司的Milli-Q水純化系統(tǒng)制備；甲醇、氯仿、正己烷、乙酸乙酯為分析純；柱層析用硅膠（上海五四化學(xué)試劑有限公司，75～150μm）。巴卡亭Ⅲ、10-去乙?；涂ㄍあ蟆⒆仙即?、10-去乙酰基．7表紫杉醇、三尖杉寧堿、10-去乙?；?-表三尖杉寧堿、10-去乙?；?7木糖基三尖杉寧堿、10-去乙酰基-7木糖基紫杉醇、10-去乙酰基-7-木糖基紫杉醇C、7-表紫杉醇由本實(shí)驗(yàn)室制備，并經(jīng)核磁共振檢測(cè)確認(rèn)。質(zhì)譜條件：全范圍掃描100～1000；殼氣（N2）：65單位，輔助氣（N2）：20單位；放電電流5μA；蒸發(fā)器溫度465℃，毛細(xì)管溫度180℃。色譜條件：MetaChem公司的Taxsil-3柱（250mm×4.6 mm）；流動(dòng)相：乙腈：水（49：51），流速：0.8mL／min，柱溫：35℃。
    2．2 樣品的處理
    取干燥的南方紅豆杉（Taxus mairei）樹皮1kg，粉碎至小于250μm，用甲醇浸提3次（5L×3），每次10h，濃縮浸提液，用正己烷萃取3次（2L×3），正己烷層舍棄，然后用氯仿和水萃取3次（2L×3），氯仿層濃縮干燥。上硅膠柱。以乙酸乙酯：正己烷（1：1）為流動(dòng)相淋洗，收集相應(yīng)的餾分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到。
    3 結(jié)果與討論
    3．1 已知的紫杉烷類化合物的分析
    通過分析已有的紫杉烷類化合物可以初步建立一個(gè)有關(guān)紫杉烷類化合物的數(shù)據(jù)庫(kù)，從而可以快速方便的分析紅豆杉提取物、中間產(chǎn)物。列出用1O種常見的紫杉烷類化合物的分子結(jié)構(gòu)信息、分子量和相對(duì)保留時(shí)間。利用液相色譜在上述條件下分析這些紫杉烷類化合物，得到各個(gè)化合物的相對(duì)保留時(shí)間，即這些化合物的色譜特征數(shù)據(jù)，從而便于實(shí)驗(yàn)室之間數(shù)據(jù)的比較對(duì)照。利用化合物在反相色譜中保留時(shí)間的長(zhǎng)短還可以大致衡量其親脂性強(qiáng)弱，有助于是解釋未知紫杉烷類化合物結(jié)構(gòu)。
    在液-質(zhì)聯(lián)用中通過質(zhì)譜分析可以獲得相關(guān)化合物分子量以及與結(jié)構(gòu)相關(guān)的碎片離子的信息，結(jié)合液相分析得到的化合物親脂性的信息，可以快速對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。10種化合物的離子碎片離子說明了這些碎片離子的產(chǎn)生方式。這些化合物的質(zhì)譜有許多共性，所有這些化合物都有與紫杉醇相同的母環(huán)結(jié)構(gòu)，zui后都會(huì)生成，m／z=509的母環(huán)特征離子；由于母環(huán)上取代基不同，各個(gè)化合物還會(huì)生成許多特征的離子，主要包括以下3類：*類是關(guān)于13位上側(cè)鏈的特征離子，許多化合物的側(cè)鏈和紫杉醇的（m／z=286）相似，僅僅是氨基所連的官能團(tuán)（R1）有所差別。這可以根據(jù)側(cè)鏈離子的荷質(zhì)比加以判斷，比如1O-去乙?；?-木糖基紫杉醇C以戊烷基代替了紫杉醇的苯基，所以它側(cè)鏈的特征離子m／z=280，比紫杉醇小了6；其次如三尖杉寧堿類的側(cè)鏈，氨基上連一個(gè)2-丁烯基，所以m／z=264；還有一些在13位沒有連大分子的基團(tuán)，就不會(huì)有相應(yīng)的特征離子，如10-乙?；涂ㄍ?1I和巴卡亭Ⅲ，它們13位都是羥基，所以沒有相應(yīng)的碎片離子。第二類是關(guān)于10位上所連的基團(tuán)的，由于1O位的基團(tuán)脫去后可以與11位的雙鍵形成能量較低的穩(wěn)定共振結(jié)構(gòu)，所以10位上的基團(tuán)很容易脫去形成相應(yīng)的中性碎片丟失，如果10位連的是乙?；?，準(zhǔn)分子離子就很容易形成60的中性碎片丟失，如果連的是羥基，則易形成18的中性碎片丟失。第三類是關(guān)于7位的，許多化合物在7位有相同的官能團(tuán)， 只是鍵的空間位置不同，這些化合物的質(zhì)譜基本上是一樣的?？紤]到大部分的紫杉烷類化合物擁有與紫杉醇相似的結(jié)構(gòu)，特別是有與紫杉醇一樣的母環(huán)結(jié)構(gòu)，所以這些物質(zhì)會(huì)和紫杉醇及其他的標(biāo)準(zhǔn)紫杉烷類化合物經(jīng)歷相似的裂解途徑。相同的特征離子和中性分子丟失，說明含有相同的結(jié)構(gòu)，相對(duì)應(yīng)的不同離子則說明了結(jié)構(gòu)上的差異。因此，用APCI／MS可以做這類化合物的精細(xì)結(jié)構(gòu)解析。
    3．2 液-質(zhì)聯(lián)用分析紅豆杉提取物
    3．2．1 未知化合物分子量的確定圖2是紫杉醇純化過程中一個(gè)中間產(chǎn)物的UV圖（227nm）和質(zhì)譜總離子流圖。這兩幅圖有很大的一致性，大部分的化合物通過液相色譜得到了很好的分離，為質(zhì)譜分析創(chuàng)造了良好的條件。由于產(chǎn)物的成分非常復(fù)雜，還有一些化合物無法達(dá)到*分離，可以憑借質(zhì)譜的質(zhì)量分析能力進(jìn)行分析。盡管有其他化合物離子峰的干擾，但還是可以判斷保留時(shí)間為14.18min的是三尖杉寧堿。
    3．2．2 提取物中紫杉烷類化合物的初步分析 迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了300多種紫杉烷類化合物。由這些化合物的結(jié)構(gòu)式可以知道其分子量，利用質(zhì)譜的選擇離子掃描可以初步判斷某一混合物中是否含有這些化合物，然后再根據(jù)質(zhì)譜的圖譜加以確認(rèn)。利用選擇離子掃描方式分析上述中間產(chǎn)物而發(fā)現(xiàn)的一些可能的紫杉烷類化合物的色譜圖。對(duì)于還未被發(fā)現(xiàn)的新化合物也可以根據(jù)質(zhì)譜圖，對(duì)其結(jié)構(gòu)做一些判斷。例如，根據(jù)化合物是否形成m／z=509的母環(huán)特征離子可以判斷該化合物是否有和紫杉醇一樣的母環(huán)。
    3．2．3 未知化合物的質(zhì)譜分析 因?yàn)樵S多紫杉烷類化合物有相似結(jié)構(gòu)，相近裂解途徑，故用APCI／MS可以做這類化合物的精細(xì)結(jié)構(gòu)解析。以圖出峰時(shí)間為7.21 min的未知化合物為例，說明用質(zhì)譜分析化合物結(jié)構(gòu)的方法。圖顯示了該化合物的大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜，對(duì)照?qǐng)D的紫杉醇的質(zhì)譜圖：它的側(cè)鏈形成m／z=268.1的離子，其母環(huán)在脫側(cè)鏈之后該化合物形成了m／z 509.1和527.1的離子，說明該化合物的側(cè)鏈與紫杉醇一樣，而母環(huán)含有與l0-去乙酰基-7 表-紫杉醇相似的結(jié)構(gòu)；準(zhǔn)分子離子峰的m／z 943.9，比l0-去乙?；?紫杉醇大132.1，同時(shí)在該物質(zhì)的圖譜中有準(zhǔn)分子離子峰脫去149.9得到的m／z=794.0的離子峰；而且該物質(zhì)在色譜中的出峰時(shí)間（7.2l
min）比紫杉醇（15.92min）早，說明該物質(zhì)比紫杉醇親脂性弱；綜合這3項(xiàng)，參照其分子量信息及已有的紫杉烷類化合物的資料，基本可以確定該化合物在母環(huán)上比紫杉醇多一個(gè)木糖基，可能是l0-去乙?；?7-木糖基-紫杉醇。
    3．3 結(jié)論
    本實(shí)驗(yàn)利用液相色譜-大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜聯(lián)用研究紫杉烷類化合物標(biāo)準(zhǔn)樣品，得到這些化合物的液相色譜保留時(shí)間、質(zhì)譜特征圖譜以及質(zhì)譜裂解規(guī)律等信息，據(jù)此可以建立一個(gè)有關(guān)紫杉烷類化合物的數(shù)據(jù)庫(kù)，用于紅豆杉的粗提物、純化紫杉醇過程中的中間產(chǎn)物的分析，本實(shí)驗(yàn)所用的方法也適用于其他天然產(chǎn)物的開發(fā)和研究，特別適用于微量成分的分析。
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