摘要：建立了毛細管電泳同時分離測定中藥石韋中綠原酸、槲皮素含量的分析方法．采用柱端噴壁式三電極系統(tǒng)的電化學檢測方式，工作電極為0．5 mm碳圓盤電極；參比電極為Ag／AgCl；輔助電極為鉑絲電極．以70cm（o．d.360μm，i．d．25μm）的熔融石英毛細管為分離通道，在*電泳介質(zhì)（pH=7.0，10.0mmol／L磷酸鹽緩沖溶液）中，當分離電壓為21kV時，兩待測物質(zhì)在8min內(nèi)*分離．在*分離、檢測條件下，響應(yīng)電流與濃度之間的線性關(guān)系良好，綠原酸、槲皮素的線性方程分別為：y=0.268x+ 1.088、y=0.312x+ 0.822，相關(guān)系數(shù)大于0.999，綠原酸、槲皮素檢測限分別達0.075μg／mL和0.020μg／mL。該方法具有良好的重現(xiàn)性，峰電流的RSD小于3.5%。已成功的用于實際中藥石韋和模擬血樣中綠原酸、槲皮素的含量測定，結(jié)果令人滿意。
關(guān)鍵詞：毛細管電泳；電化學檢測；綠原酸；槲皮素；石韋
天然植物石韋味苦、性微寒，歸肺、膀胱經(jīng)．具有利尿通淋，清熱止血的功效。綠原酸（Chlorogenic acid，簡稱CGA）和槲皮素（Quercetin，簡稱QC）是石韋中的主要指標成分，綠原酸具有利膽、抗菌、降壓、增高白血球及興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等功能。槲皮素具有抗自由基、抗氧化、抗病毒、抗癌及抗糖尿病等作用。
已有報道用毛細管電泳-紫外檢測法測定了單組分的綠原酸以及混合物中的綠原酸。劉永明等對槲皮素在玻碳電極上伏安行為進行了研究，證明槲皮素在玻碳電極上的反應(yīng)是準可逆反應(yīng)。槲皮素和綠原酸同時測定的分析方法還未見報道。
毛細管電泳-電化學檢測法（CE-ED）對具有電化學活性的天然藥物成分分析具有明顯的*性，靈敏度高、分離效率高、樣品不需要預(yù)處理，設(shè)備簡單等特點，不但使常規(guī)的中藥成分的檢測更加便捷，而且為藥物代謝動力學研究所需要的血樣中痕量代謝產(chǎn)物的測定提供了可能，因此CE-ED聯(lián)用的分析方法越來越受到中藥研究者的重視。
1 實驗部分
1．1 儀器和試劑
自組裝的毛細管電泳-電化學檢測系統(tǒng)：高壓電源（士3OkV（中國科學院上海原子核研究所），未涂層熔融石英毛細管（φ25μmx 70cm，河北永年光纖廠），三電極工作系統(tǒng)（O.5mm碳圓盤電極，鉑對電極， Ag /AgC1參比電極），BAS LC-4C型電化學檢測器（Bioanalytical System，West LafayeRe，In，USA）用于控制恒電位下電化學反應(yīng)，TL9900色譜工作站（北京泰立化電子技術(shù)有限公司）用于處理色譜儀信號數(shù)據(jù)，pHS-2C型精密酸度計（上海第二分析儀器廠），超聲波清洗器（Branson，USA）。標準品綠原酸和槲皮素均由北京藥品生物制品檢定所提供；中藥石韋采購于福州藥店和江西藥店；其它實驗用化學試劑均為AR級，水為二次蒸餾水。
1．2 實驗方法
1．2．1 標準溶液配制
準確稱量1.0mg綠原酸和1.0mg槲皮素，分別用2.0mL乙醇溶解，然后用15mmol／L的磷酸鹽（pH=7.0）的緩沖溶液定容至10mL，配制成0.10mg／mL的儲備液。
1．2．2 樣品溶液制備
將一定量的石韋藥材洗凈、烘干后磨碎．準確稱取100mg石韋，用二次水煎煮2h或乙醇提取3h，放置12h，然后，將提取好的石韋過濾，用運行液定容于100mL的容量瓶，備用。分別提取了江西、福州兩個產(chǎn)地的石韋。
取健康人血樣10mL用高速離心機離心后，取血清部分，即為血液空白樣。在血清中準確加人一定量綠原酸和槲皮素標準溶液，振蕩、超聲5min，精密吸取0.10mL上層清液，用緩沖液稀釋至1.0mL，模擬樣品中的CGA和QA的濃度均為1.0μg／mL。
所有溶液在使用前均用聚乙烯濾膜（0.22μm）過濾，并經(jīng)超聲波除去細小氣泡．
1．2．3 毛細管處理
未使用過的毛細管先用0.50mol／L的NaOH溶液活化3h，再用二次水沖洗15min，zui后依次用0.050 mol／L NaOH、二次水溶液沖洗．每運行5次以后，毛細管先以0.050 mol／L NaOH 溶液洗3min，再用二次水洗3min，而后換成電泳液施加高壓使其平衡穩(wěn)定3min。 21kV下電動進樣10s，然后進行分離分析測定．所有實驗均在室溫下進行。
2 結(jié)果與討論
2．1 靜態(tài)與動態(tài)伏安圖
電化學檢測作為毛細管電泳zui靈敏檢測方法之一，選擇被分析物質(zhì)的*工作電位是非常重要的。為此考察了綠原酸（CGA）和槲皮素（QC）的電化學行為，首先將兩個被測物進行循環(huán)伏安實驗，得到靜態(tài)伏安圖。從圖中可以看出綠原酸和槲皮素均有氧化峰，說明兩物質(zhì)均有電化學活性。
進一步考察了在pH 7.0，10.0mmol／L磷酸鹽（PB）緩沖溶液中綠原酸和槲皮素于碳圓盤電極上的動態(tài)伏安圖。從圖中可以看出，綠原酸和槲皮素的氧化峰電流都隨著電極電位的增大而增大。當電極電位低于800mV時，綠原酸和槲皮素產(chǎn)生的峰電流很小，這意味著綠原酸和槲皮素此時在電極上幾乎不發(fā)生電化學反應(yīng)。電位范圍在800～1000mV時，綠原酸的峰電流急劇增大，而槲皮素的峰電流卻增加緩慢。當電位大于1000mV時，綠原酸和槲皮素的響應(yīng)電流繼續(xù)增加，然而此時基流也開始急劇增大，這種情況使實驗中使用的測量和記錄系統(tǒng)難以達到要求，而且很不穩(wěn)定．因此選1000 mV為*的工作電位，在此電位下，不僅信噪比zui大，而且工作電極可以在較長的時間內(nèi)保持良好的穩(wěn)定性．
2．2 緩沖液的pH值和濃度的影響
由于離子電荷和粒徑取決于溶質(zhì)在溶液中的溶解、離解、締和等因素，因此溶質(zhì)的成分和濃度決定了其在毛細管中的遷移行為；同時，電泳液酸度對毛細管內(nèi)壁的電荷則起決定作用，因此運行液的性質(zhì)、酸度和濃度共同決定了分離的電滲流，從而決定了分離效率．分別試驗了檸檬酸鹽、硼砂、磷酸鹽、醋酸鹽四種緩沖液對被分析物分離效果的影響，結(jié)果表明綠原酸和槲皮素在磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中的分離效果．
進一步考察了酸度對分離的影響，在4.O～9.0范圍內(nèi)PBS的pH值與遷移時間的關(guān)系如圖所示表明，槲皮素的遷移時間隨著pH的增大而增大，而酸度對綠原酸的遷移時間幾乎沒有影響，因而兩者的分離度隨pH增大而增大。pH在7.0附近時兩組分已經(jīng)可以*分離，為了節(jié)約分析時間，所以選擇*酸度為pH 7.0。
研究了5.O～25.0mmol／L的緩沖液濃度對分離度及遷移時間的影響，結(jié)果標明：隨著PBS濃度的降低，兩待測物質(zhì)的遷移時間都隨濃度的降低有不同程度的降低。當濃度大于或者等于10.0 mmol／L時，綠原酸和槲皮素能得到很好的分離．為了保證較好的分離效果，又節(jié)省分離時間，選擇10.0mmol／L的PBS（pH 7.0），為*運行液。
2．3 分離電壓和進樣量的影響
分離電壓對分離時間和分離效果通常也有較大影響。當毛細管長度固定時，遷移時間與外加電壓成反比。實驗了分離電壓為15、18、21、24、27kV時兩待測物質(zhì)的遷移時間，結(jié)果表明隨著分離電壓的增大，兩待測物質(zhì)的遷移時間逐漸減小。高壓有利于提高分離速度，可是，過大的電壓則使毛細管內(nèi)電流顯著增大，從而引起焦耳熱。為了保證分離效率，實驗時選擇21 kV為分離電壓。由于本實驗采用電動進樣，因而進樣時間會直接影響到檢測靈敏度。在21 kV電壓下，分別設(shè)置進樣時間為2、5、10、15s時測量峰高。結(jié)果表明，響應(yīng)峰電流隨著進樣時間的延長而增大，但當進樣時間大于10s時，峰形有明顯的展寬，因此選擇進樣時間為10s（21kV）。
為在*條件下綠原酸和槲皮素的標準混合液的電泳圖可見，兩個被測物在8min內(nèi)可以達到基線分離。
2．4 方法的特性
用CE-ED方法，在上述選定條件下，對一系列不同濃度的綠原酸和槲皮素標準混合樣品進行分析測定，以電泳譜圖中的峰高Y（nA）分別對綠原酸和槲皮素濃度X（μg／mL）進行回歸分析，所得到的綠原酸和槲皮素的線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢測限如表所示（每一份樣品平均測定5次）。綠原酸和槲皮素的線性范圍分別為：0.10～10.0μg／mL和0.050～1O.0μg／mL，其直線方程的相關(guān)系數(shù)（R2）大于0.999。以三倍信噪比確定綠原酸和槲皮素的檢測
限分別為：0.075、0.020μg／mL．表明本方法線性良好，靈敏度高。
2．5 天然植物石韋樣品測定及其回收率的測定
在上述優(yōu)化的條件下，按照1．2．2所敘述的方法分別用水或乙醇提取福州、江西兩地石韋樣品，不需預(yù)處理，直接電動進樣，實際石韋樣品的電泳譜圖，對照圖標準電泳譜圖可知，用水煮法提取的福州石韋樣品電泳譜圖與標準譜圖*相符，而用乙醇提取的江西石韋樣品譜圖中的槲皮素的出峰時間延長將近1min，這可能是由于樣品帶中的乙醇對被測組分遷移時間造成一定的影響。雖然天然藥物含有復(fù)雜的成分，但因為其中少有容易被電化學氧化的物質(zhì)，因此電泳圖譜中除了綠原酸和槲皮素兩組分以外，未出現(xiàn)了明顯的非測定物質(zhì)的譜峰，說明背景物質(zhì)對石韋樣品的測定并沒有造成干擾。記錄所得的峰電流，根據(jù)表1中的回歸方程計算，得到的天然藥物石韋的分析結(jié)果總結(jié)于下表。
為了進一步驗證毛細管電泳-電化學檢測法用于定量分析石韋時的綠原酸和槲皮素的可行性，進行了回收率實驗。在1.0mL石韋藥材的樣品加入1.0、2.0和5.0μg綠原酸；2.O、4.0和10.0μg槲皮素，測定峰電流，根據(jù)回歸方程計算得綠原酸和槲皮素含量，扣除原來樣品中綠原酸和槲皮素的量以后，進行回收率計算，結(jié)果列于表可見，石韋藥材中的綠原酸和槲皮素回收率在94.5%～105%之間，*實際樣品對分析方法的要求，證明該方法用于石韋的測定是準確的、可靠的。
2．6 模擬生物體液樣品的測定
在上述優(yōu)化的條件下，按照1．2．2所敘述的方法提取模擬血樣以后，不需預(yù)處理，直接電動進樣分離，人體血樣的電泳譜圖。通過加標試驗，證明電泳譜圖中的峰a和峰b分別是綠原酸和槲皮素。血樣中不明物質(zhì)峰對綠原酸和槲皮素的測定不形成干擾。
3 結(jié)論
建立了毛細管電泳-電化學檢測同時測定石韋中的綠原酸和槲皮素的方法。該法靈敏度高、選擇性好，簡單、快速，用于模擬血樣中綠原酸和槲皮素的分析，結(jié)果同樣令人滿意。因此，該方法不但可作為控制與保障天然藥物石韋質(zhì)量的手段，在藥物代謝機理的研究方面也有一定的應(yīng)用前景。
參考文獻：
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