Real-time qPCR技術(shù)的定量原理：

一、擴(kuò)增曲線

在Real-time qPCR中，對(duì)整個(gè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行了實(shí)時(shí)的檢測(cè)并記錄其熒光信號(hào)，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，監(jiān)測(cè)到的熒光信號(hào)可以繪制成一條曲線，即為擴(kuò)增曲線。

熒光擴(kuò)增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長(zhǎng)期和平臺(tái)期。

在Real-time qPCR擴(kuò)增早期，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化，此時(shí)即為基線期。

PCR反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的，隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加，最終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)形式生成模板，從而進(jìn)入“平臺(tái)期”。在該時(shí)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無(wú)線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出初始模板量。

只有在熒光信號(hào)的指數(shù)增長(zhǎng)期，PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。

                                                                 擴(kuò)增曲線和Ct值

二、熒光閾值

為了便于對(duì)所檢測(cè)樣本進(jìn)行比較，首先需設(shè)定一個(gè)熒光信號(hào)的閾值，熒光閾值是在擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，一般熒光閾值設(shè)置為3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，但實(shí)際應(yīng)用時(shí)要結(jié)合擴(kuò)增效率、線性回歸系數(shù)等參數(shù)來(lái)綜合考慮。

通常熒光閾值都是Real-time qPCR儀器自動(dòng)設(shè)置，如無(wú)特殊情況，無(wú)需更改。

三、循環(huán)閾值

循環(huán)閾值 (Cycle threshold valve, Ct) 即Real-time qPCR擴(kuò)增過(guò)程中擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的熒光閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)，Ct值與熒光閾值有關(guān)。

一般Ct值位于指數(shù)增長(zhǎng)期的開(kāi)始階段，此時(shí)樣品間細(xì)小物差尚未放大且擴(kuò)增效率也相對(duì)恒定，因此該Ct值具有重復(fù)性，盡管平臺(tái)期的DNA拷貝數(shù)波動(dòng)很大，Ct值卻是相對(duì)固定的。