逆轉錄是指以 RNA 為模板，合成與其互補的 cDNA 的過程。逆轉錄 PCR 是將 RNA 的逆轉錄（reverse transcription）和 cDNA 的聚合酶鏈式反應（PCR）相結合的技術，故逆轉錄稱為 RT-PCR 或反轉錄 PCR。逆轉錄 PCR 實驗原理為：提取組織或細胞中的總 RNA，以 RNA 為模板，首先在利用逆轉錄酶反轉錄成 cDNA，再以 cDNA 鏈為模板進行 PCR 擴增，從而獲得大量拷貝。逆轉錄 PCR 的出現(xiàn)使 RNA 檢測的靈敏性提高了幾個數(shù)量級，使一些極為微量 RNA 樣品分析成為可能。

一、模板：

逆轉錄 PCR 的模板是 RNA，可以是總 RNA、mRNA 或體外轉錄的 RNA 產(chǎn)物。無論使用何種 RNA，都需確保 RNA 中無 RNA 酶和基因組 DNA 的污染。

二、RNA 提取：

可以利用試劑盒從細胞（或組織）中提取得到 RNA。模板 RNA 的純度和完整性對于擴增的結果有很大影響，從細胞中分離 RNA 應注意盡量減少 RNA 酶的污染（RNA 酶分布廣泛，除細胞內源性 RNA 酶外環(huán)境中也存在大量 RNA 酶），在提取 RNA 時，應盡量創(chuàng)造一個無 RNA 酶的環(huán)境：避免 RNA 酶污染包括去除外源性 RNA 酶污染和抑制內源性 RNA 酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性 RNA 酶，通過 RNA 酶的阻抑蛋白 Rnasin 和強力的蛋白質變性劑抑制內源性 RNA 酶。

三、引物

用于反轉錄的引物有隨機引物、通用引物（Oligo-dT）及基因特異性引物三種，下表為三種引物的介紹：

引物最好選擇 Oligo-dT 或基因特異性引物，隨機引物會從 RNA 的多個位點(包括核糖體 RNA)開始轉錄，特異性低。Oligo-dT 引物同大多數(shù)真核細胞 mRNA3'端的 poly(A)尾雜交，與使用隨機引物相比特異性高。但是 Oligo-dT 引物對 RNA 樣品的質量要求較高，對于從福爾馬林固定的組織中提取的劣質 RNA 不適合用 Oligo-dT 引物。

四、逆轉錄酶

逆轉錄酶是存在于 RNA 病毒體內的依賴 RNA 的 DNA 聚合酶。RT-PCR 實驗中的逆轉錄酶需要具有以下三種活性

1. 依賴 RNA 的 DNA 聚合酶活性：以 RNA 為模板合成 cDNA 的第一條鏈；

2. Rnase 水解活性：水解 Rnase 雜合體中的 RNA;

3. 依賴 DNA 的 DNA 聚合酶活性：以一條 DNA 鏈為模板合成互補的雙鏈 DNA

在選擇逆轉錄酶時，建議選擇無 RNaseH①活性（RNaseH-）的逆轉錄酶。具有 RNaseH 活性的逆轉錄酶的 RNaseH 活性會與聚合酶活性競爭 RNA 模板與 DNA 引物（或 cDNA 延伸鏈）形成的雜合鏈，并降解雜合鏈中的 RNA 鏈。被 RNaseH 活性所降解的 RNA 模板不能再作為合成 cDNA 的有效底物，降低了 cDNA 合成的產(chǎn)量與長度。

逆轉錄 PCR 應用：

逆轉錄 PCR 的用途廣泛，可用于分析基因的轉錄產(chǎn)物、檢測細胞中 RNA 病毒的含量、合成 cDNA 探針、直接克隆特定基因的 cDNA 序列等。如在臨床上 RT-PCR 可以用于遺傳病診斷、癌癥檢測、檢測病人標本中的 RNA 病毒，如 HAV、HCR、HIV 等。在植物方面 RT-PCR 常用于研究環(huán)境脅迫對植物基因表達的影響，以及在特定的環(huán)境或生長階段中植物體不同部位基因表達的差異性。使用 RT-PCR 檢測分析 RNA 轉錄產(chǎn)物具有以下突出的優(yōu)點：

1、 理論上可以檢測幾乎任何基因的轉錄產(chǎn)物；

2、可以實現(xiàn)極為微量 RNA 樣品（ng 級別）的檢測；

3、樣品耐受性好，未經(jīng)純化的粗制生物樣品也可以用于檢測；

實驗流程：

從細胞材料中提取 RNA→RNA 加入到含有逆轉錄酶、引物、dNTPs 的反應體系中→退火，引物與 RNA 鏈配對→延伸，逆轉錄酶合成互補 cDNA 鏈變性→常規(guī) PCR 反應流程（變性、退火、延伸，如此多次循環(huán)）。

RT-PCR“兩步法”與“一步法”：

RT-PCR 的實驗操作分為“一步法”與“兩步法”兩種。一步法 RT-PCR 能克隆微量 mRNA 而不需構建 cDNA 文庫（即 cDNA 合成與 PCR 反應在同一 Buffer 及酶中進行，一步法完成），省略了 cDNA 與 PCR 之間的過程。兩步法 RT-PCR 首先用反轉錄酶合成 cDNA，然后以 cDNA 為模板進行 PCR，即 RNA 反轉錄與 PCR 擴增分兩步進行。一步法 RT-PCR 與兩步法相比快速、簡便、減少了污染機會、減少了 RNA 二級結構、減少了 PCR 反應的錯配率。RT-PCR 兩步法的優(yōu)勢在于存在中間產(chǎn)物 cDNA，便于保存；且第二步 PCR 只取逆轉錄反應產(chǎn)物的 1/10 進行反應，有利于 PCR 條件的調整，實驗重現(xiàn)性強；兩步法可以在第二步 PCR 反應體系中加入特異性引物，其靈敏度比一步法高；兩步法的實驗預算要低于一步法。但是由于兩步法包括第一鏈 cDNA 合成和隨后的 PCR 反應，容易產(chǎn)生污染問題。

實驗操作注意事項：

1、RNA 提取一定要迅速，樣本要新鮮，組織盡量在液氮中研磨；

2、 RNA 提取完馬上進行逆轉錄不要拖延，新提的 RNA 很容易降解； 

3、逆轉錄反應過程，需建立無 RNAase 環(huán)境，以避免模板 RNA 降解； 

注：

  RNase 是 RNA 水解酶的統(tǒng)稱，包含 RNase A，RNase H 等，RNase A 可以水解單雙鏈 RNA，RNase H 主要水解 RNA 與 DNA 雜交雙鏈中的 RNA。