開展植物組織培養(yǎng)工作需要一個(gè)比較合理實(shí)用的場所，一套適宜的設(shè)備和提供必要的實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件，這是首先要考慮到的。根據(jù)科學(xué)、合理的原則，一個(gè)較為理想的配置應(yīng)該包括：
1、化學(xué)藥品室
2、配培養(yǎng)基室
3、滅菌室
4、接種室
5、無菌培養(yǎng)室

基本儀器設(shè)備與用品

1、儀器設(shè)備
超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋（手提式、立式或臥式）、小推車（可選）、精密電子天平（至少千分之一）、電子天平或托盤天平、酸度計(jì)、普通冰箱、烘箱、解剖鏡、光照培養(yǎng)箱（選購）、電爐、微量可調(diào)移液器及配套吸嘴、移液管架、磁力攪拌器（可選）、不銹鋼托盤、灌裝機(jī)（可選）、培養(yǎng)架、定時(shí)器（控制光照時(shí)間）、紫外線殺菌燈、照度計(jì)（可選）、溫濕度計(jì)（可選）蒸餾水器、搖床（可選）、針頭濾器及配套濾膜

2、小型用品
槍鑷，彎剪、解剖刀、接種盤

3、玻璃器皿
組培瓶（玻璃或塑料）、燒杯、量筒、移液管、試劑瓶、移液管架、容量瓶、試管、酒精、玻璃棒、滴瓶

4、組培藥品 （詳細(xì)藥品請見常用配方）

5、其他
吸耳球、刷子、記號筆、定時(shí)鐘、手套、封口膜、衛(wèi)生藥棉、拖鞋、口罩、白大褂、濾紙、洗瓶

培養(yǎng)條件

   在植物組織培養(yǎng)中溫度、光照、濕度等各種環(huán)境條件，培養(yǎng)基組成、 PH值、滲透壓等各種化學(xué)環(huán)境條件都回影響組織培養(yǎng)育苗的生長和發(fā)育。

    一、溫度（temperature）

    因?yàn)闇囟仁侵参锝M織培養(yǎng)中的重要因素，所以植物組織培養(yǎng)在zui適宜的溫度下生長分化才能表現(xiàn)良好，大多數(shù)植物組織培養(yǎng)都是在 23～27 ℃之間進(jìn)行，一般采用 25±2℃。低于15℃時(shí)培養(yǎng)，植物組織會(huì)表現(xiàn)生長停止，高于35℃時(shí)對植物生長不利。但是，不同植物培養(yǎng)的適溫不同。白鶴非的zui適溫度是20℃、月季是25～27℃、番茄是28℃。溫度不僅影響植物組織培養(yǎng)育苗的生長速度，也影響其分化增殖以及器官建成等發(fā)育進(jìn)程。如煙草芽的形成以28℃為，在12℃以下，33℃以上形成率皆zui低。
    不同培養(yǎng)目標(biāo)采用的培養(yǎng)溫度也不同，百合鱗片在30℃以下再生的小鱗莖的發(fā)葉速度和百分率比在25%以下的高。桃胚在2～５℃條件進(jìn)行一定時(shí)間的低溫處理，有利于提高胚培養(yǎng)成活率。用35℃處理草莓的莖尖分生組織3～５d，可得到無病毒苗。

    二、光照（light）

    組織培養(yǎng)中光照也是重要的條件之一，主要表現(xiàn)在光強(qiáng)、光質(zhì)、以及光照時(shí)間方面：
    1、光照強(qiáng)度（light intensity）
    光照強(qiáng)度對培養(yǎng)細(xì)胞的增殖和器官的分化有重要影響，從目前的研究情況看，光照強(qiáng)度對外植物體、細(xì)胞的zui初分裂有明顯的影響。一般來說，光照強(qiáng)度較強(qiáng)，幼苗生長的粗壯，而光照強(qiáng)度較弱幼苗容易徒長。
    2、光質(zhì)（light wave）
    光質(zhì)對愈傷組織誘導(dǎo)，培養(yǎng)組織的增殖以及器官的分化都有明顯的影響。如百合珠芽在紅光下培養(yǎng)，8周后，分化出愈傷組織。但在藍(lán)光下培養(yǎng)，幾周后才出現(xiàn)愈傷組織，而唐菖蒲子球塊接種15天后，在藍(lán)光下培養(yǎng)首先出現(xiàn)芽，形成的幼苗生長旺盛，而白光下幼苗纖細(xì)。
    3、光周期（light period）
    試管苗培養(yǎng)時(shí)要選用一定的光暗周期來進(jìn)行組織培養(yǎng)，zui常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。研究表明，對短日照敏感的品種的器官組織，在短日照下易分化，而在長日照下產(chǎn)生愈傷組織，有時(shí)需要暗培養(yǎng)，尤其是一些植物的愈傷組織在暗培養(yǎng)下比在光下更好。如紅花、烏飯樹的愈傷組織。

    三、濕度（humidity）

    濕度的影響包括培養(yǎng)容器保持和環(huán)境的濕度條件，容器內(nèi)主要受培養(yǎng)基水分含量和封口材料的影響。前者又受瓊脂含量的影響。在冬季應(yīng)當(dāng)適當(dāng)減少瓊脂用量，否則，將使培養(yǎng)基干硬，以致不利于外植體接觸或插進(jìn)培養(yǎng)基，導(dǎo)致生長受阻。封口材料直接影響容器內(nèi)濕度情況，但封閉性較高的封口材料易引起透氣性受阻，也會(huì)導(dǎo)致植物生長發(fā)育受影響。
   環(huán)境的相對濕度可以影響培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，一般要求70%-80%的相對濕度，常用加濕器或經(jīng)常灑水的方法來調(diào)節(jié)濕度。濕度過低會(huì)使培養(yǎng)基喪失大量水分，導(dǎo)致培養(yǎng)基各種成分濃度的改變和滲透壓的升高，進(jìn)而影響組織培養(yǎng)的正常進(jìn)行。濕度過高時(shí)，易引起棉塞長霉，造成污染。

    四、滲透壓（penetrating pressure）

    培養(yǎng)基中由于有添加的鹽類、蔗糖等化合物，因此，而影響到滲透壓的變化。通常1-2個(gè)大氣壓對植物生長有促進(jìn)作用，2個(gè)大氣壓以上就對植物生長有阻礙作用，而5-6個(gè)大氣壓植物生長就會(huì)*停止，6個(gè)大氣壓植物細(xì)胞就不能生存。

     五、PH值

    不同的植物對培養(yǎng)基zui適PH值的要求也是不同的（見表），大多在5-6.5左右，一般培養(yǎng)基皆要求5.8，這基本能適應(yīng)大多數(shù)植物培養(yǎng)的需要。

不同植物的zui適PH值

    PH值適度因材料而異，也因培養(yǎng)基的組成而不同。以硝態(tài)氮作氮源和以銨態(tài)氮作氮源就不一樣，后者較高一些。一般來說PH值高于6.5時(shí)，培養(yǎng)基全變硬；低于5時(shí)，瓊脂不能很好地凝固。因?yàn)楦邷販缇鷷?huì)降低PH值（約0.2-0.3個(gè)PH值）因此在配制時(shí)常提高PH值0.2-0.3單位。PH值大小調(diào)節(jié)可用0.1M的NaOH和0.1M的HCl來調(diào)整。1ml的NaOH可使PH值升高0.2單位，1ml的HCl可使PH值降低0.2單位。調(diào)節(jié)時(shí)一定要充分?jǐn)嚢杈鶆颉?/p>

    六、氣體（gas）

氧氣是組織培養(yǎng)中必需的因素，瓶蓋封閉時(shí)要考慮通氣問題，可用附有濾氣膜的封口材料。通氣的是棉塞封閉瓶口，但棉塞易使培養(yǎng)基干燥，夏季易引起污染。固體培養(yǎng)基可加進(jìn)活性炭來增加通氣度，以利于發(fā)根。培養(yǎng)室要經(jīng)常換氣，改善室內(nèi)的通氣狀況。液體振蕩培養(yǎng)時(shí)，要考慮振蕩的次數(shù)、振幅等，同時(shí)要考慮容器的類型、培養(yǎng)基等。

     培養(yǎng)基的成分

 培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)中的“血液”，血液的成分及其供應(yīng)狀況直接關(guān)系到培養(yǎng)物的生長與分化，因此了解培養(yǎng)基的成分、特點(diǎn)及其配制至關(guān)重要。自然狀態(tài)下生長的綠色植物由于自身能進(jìn)行光合作用，并且能合成植物生長發(fā)育所需的幾乎所有有機(jī)成分，加上土壤中含有較全面的無機(jī)和有機(jī)營養(yǎng)成分，所以只需在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候施加少量的無機(jī)和有機(jī)肥（復(fù)合成分），植物就可良好的生長。但是，在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)時(shí)，只是切取植物體的一小部分，它們無法合成生長發(fā)育所需要的全部物質(zhì)，加上人們對植物體的各種組織和器官所需營養(yǎng)成分了解甚少，因此對培養(yǎng)基的組成成分的探索走過了一條十分艱苦而漫長的道路，至今人們還不能*達(dá)到自主的階段。在所報(bào)道的培養(yǎng)基中，沒有任何一種培養(yǎng)基能夠適合所有類型的植物組織和器官，也沒有實(shí)現(xiàn)對所有的植物都能通過組織培養(yǎng)使其再生的目的。由于植物的多樣性和生長環(huán)境的復(fù)雜性與多變性，也不可能有一種的培養(yǎng)基。目前所使用的培養(yǎng)基有10余種之多，大部分都是在前人研究的基礎(chǔ)上經(jīng)過分析綜合和改進(jìn)而成的。例如，White培養(yǎng)基是Uspenski和Uspenskaia（1925）的藻類培養(yǎng)基演化的結(jié)果，被廣泛用于根的培養(yǎng)；Cautheret培養(yǎng)基是建立在Knop營養(yǎng)液（1865）基礎(chǔ)上的。以后的培養(yǎng)基大部分是在White和Cautheret培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上改進(jìn)而成。

  就目前所使用的各種培養(yǎng)基而言，可將它們的成分劃分為幾大類，
    1、 水  
         水是植物原生質(zhì)體的組成成分，也是一切代謝過程的介質(zhì)和溶媒。它是生命活動(dòng)過程中*的物質(zhì)。配制培養(yǎng)基母液時(shí)要用蒸餾水，以保持母液及培養(yǎng)基成分的性，防止儲(chǔ)藏過程發(fā)霉變質(zhì)。大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)可用自來水。但在少量研究上盡量用蒸餾水，以防成分的變化引起不良效果。
    2、 無機(jī)營養(yǎng)成分（包括大量元素，微量元素和鐵鹽）    
    3、有機(jī)營養(yǎng)成分（包括維生素，氨基酸及其微生物等）
     4、碳水化合物
    5、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)（常稱為激素）
    6、 瓊脂或其他支持物
     7、 其他添加劑 （含天然提取物、抗生素等）
 ·維生素B1（鹽酸硫胺素）

·維生素 B2（核黃素）

·維生素 B6（吡多辛）

·維生素 C（抗壞血酸）

·維生素 E（生育酚）

·維生素 A（維生素甲、視黃醇）

·維生素 AD（魚肝；由丸）

·阿發(fā)骨化醇

·蘆丁 （維生素P）蘆?。ňS生素P）

維生素 B6，鹽酸吡哆醇 　　用途： 主要用于防治皮膚粗糙、粉刺、日光曬傷、止癢。也適用于防治脂溢性脫發(fā)、皮膚炎癥、一般性痤瘡，脂溢性濕疹和落屑性皮膚等化妝品制劑?？芍瞥筛嗨⑷橐汉痛既芤?。一般與其他維生素配合使用。

技術(shù)指標(biāo)： 中文名稱： 維生素 B6，鹽酸吡哆醇 英文名稱： Vitamin B6，Pyridoxin 　　化學(xué)名稱： 6—甲基—5—羥基—3，4—吡啶二甲醇鹽酸鹽　質(zhì)量指標(biāo)：熔 　點(diǎn)：205～209℃　鑒 　別：本品的紅外吸收圖譜應(yīng)與對照的圖譜一致。酸 　度：PH值應(yīng)為2.4—3.0產(chǎn)品說明： 性 　 狀： 白色或類白色的結(jié)晶或結(jié)晶性粉末；無臭，味酸苦；遇光漸變質(zhì)。在水中易溶，在乙醇中微溶，在氯仿或乙醚中不溶。水溶液呈微酸性反應(yīng)。吡哆醇是醇式維生素B6，是較穩(wěn)定的一種結(jié)構(gòu)，在酸性或堿性溶液中可耐熱

維生素 B1（鹽酸硫胺素） 作 用 主要用於防治缺乏維生素B1所致的腳氣病。也用於神經(jīng)炎、心肌炎、消化不良輔助治療。甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)患者，妊娠或高熱患者，可適當(dāng)補(bǔ)充維生素B1，以改善癥狀。 羅納普朗克動(dòng)物營養(yǎng)公司的鹽酸硫胺素（維生素B1）是鹽酸銨素粉狀產(chǎn)品，符合美國藥典標(biāo)準(zhǔn)。組成: 化學(xué)式 C12H17C1N4OL HCI

維生素B4 Vitamin B4（腺嘌呤，氨基嘌呤，Adenine　phosphate）【性狀】常用其磷酸鹽，為白色針狀結(jié)晶或結(jié)晶性粉末。易溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚或氯仿。其飽和水溶液呈中性?！舅幚砑皯?yīng)用】本品是核酸的組成成分，在體內(nèi)參與RNA和DNA合成。當(dāng)白細(xì)胞缺乏時(shí)，它能促進(jìn)白細(xì)胞增生，一般用藥2～4周左右，白細(xì)胞數(shù)目可增加。用于各種原因如放射治療、苯中毒、抗腫瘤藥和抗甲狀腺藥等引起的白細(xì)胞減少癥，也用于急性粒細(xì)胞減少癥。

葉酸（維生素BC，維生素M）水溶性；維生素B族中的一種，亦稱為維生素BC或維生素M； 　　計(jì)量單位是微克（mcg）； 是制造紅血球*的物質(zhì)； 幫助蛋白質(zhì)的代謝。

-生物素（d-biotin, 1）又名維生素H，屬水溶性維生素B族。 d-生物素是轉(zhuǎn)化酶的輔酶R，也是蛋白質(zhì)和脂肪中間代謝中的一個(gè)重要輔酶，在維持人和動(dòng)物正常生長發(fā)育，保護(hù)皮膚，羽毛和骨髓健康起著*的作用。因而為醫(yī)療，多維制劑和飼料行業(yè)等方面得以廣泛應(yīng)用。

生物素的補(bǔ)充物為右旋生物素（ D-生物素）制劑，純品一般含 D-生物素98％以上，是一種近白色結(jié)晶性粉末，在冷水中溶解度低，隨水溫升高其溶解度增加，但高溫時(shí)穩(wěn)定性受到影響，配制生物素溶液時(shí)，zui適溫度為50℃左右。生物素是穩(wěn)定性較好的一種維生素，對氧化、還原、微量元素都很穩(wěn)定，強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、紫外線對生物素稍有影響，生物素對熱敏感。

D-生物素（維生素H）

化學(xué)名稱： D-Biotin（VITAMIN H）

標(biāo)準(zhǔn)： USP24/BP98

規(guī)格：醫(yī)藥級（≥ 99.0%）飼料級（≥2%）

二四滴（ 2，4-dichlorophenoxyaceticacid，2，4-D） 一種人工合成的具有與生長素類似生理效應(yīng)的有機(jī)物?；瘜W(xué)名稱為2，4-二氯苯氧乙酸，合成過程簡單，可以大量生產(chǎn)，在農(nóng)業(yè)及園藝生產(chǎn)上已廣泛應(yīng)用。低濃度具有促進(jìn)插枝生根，阻止器官脫落，形成無子果實(shí)等作用，如10～15ppm（1ppm=10-6）溶液蘸花或噴灑花簇，即可得到無子果實(shí)；高濃度可殺死雙子葉植物，作為單子葉植物小麥、玉米、高梁等田間的除草劑。

吲哚丁酸 （IBA）和一種植物細(xì)胞分裂素：

6—芐基腺嘌吟（6—BA）

D-生物素/VH

葉酸 /VBc

萘乙酸簡稱ＮＮＡ，是一種植物生長調(diào)節(jié)劑，近年來在果樹生產(chǎn)上應(yīng)用十分廣泛 .

培養(yǎng)基的種類

    培養(yǎng)基有許多種類，根據(jù)不同的植物和培養(yǎng)部位及不同的培養(yǎng)目的需選用不同的培養(yǎng)基。
   培養(yǎng)基的產(chǎn)生zui早是Sacks（1680）和Knop（1681），他們對綠色植物的成分進(jìn)行了分析研究，根據(jù)植物從土中主要是吸收無機(jī)鹽營養(yǎng)，設(shè)計(jì)出了由無機(jī)鹽組成的Sacks和Knop溶液，至今仍在作為基本的無機(jī)鹽培養(yǎng)基得到廣泛應(yīng)用。以后根據(jù)不同目的進(jìn)行改良產(chǎn)生了多種培養(yǎng)基，White培養(yǎng)基在40年代用得較多，現(xiàn)在還常用。而到60和70年代則大多采用MS等高濃度培養(yǎng)基，可以保證培養(yǎng)材料對營養(yǎng)的需要，并能生長快、分化快，且由于濃度高，在配制、消毒過程中某些成分有些出入，也不致影響培養(yǎng)基的離子平衡。
    培養(yǎng)基的名稱，一直根據(jù)沿用的習(xí)慣。多數(shù)以發(fā)明人的名字來命名，如White培養(yǎng)基，Murashige和Skoog培養(yǎng)基（簡稱MS培養(yǎng)基），也有對某些成分進(jìn)行改良稱作改良培養(yǎng)基。
    目前上流行的培養(yǎng)基有幾十種，常用的培養(yǎng)基及特點(diǎn)如下：
    （1）MS培養(yǎng)基   它是1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。特點(diǎn)是無機(jī)鹽和離子濃度較高，為較穩(wěn)定的平衡溶液。其養(yǎng)分的數(shù)量和比例較合適，可滿足植物的營養(yǎng)和生理需要。它的硝酸鹽含量較其他培養(yǎng)基為高，廣泛地用于植物的器官、花藥、細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)，效果良好。有些培養(yǎng)基是由它演變而來的。
    （2）B5培養(yǎng)基  是1968年由Gamborg等為培養(yǎng)大豆根細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。其主要特點(diǎn)是含有較低的銨，這可能對不少培養(yǎng)物的生長有抑制作用。從實(shí)踐得知有些植物在B5培養(yǎng)基上生長更適宜，如雙子葉植物特別是木本植物。
    （3）White培養(yǎng)基   是1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計(jì)的。1963年又作了改良，稱作White改良培養(yǎng)基，提高了MgSO 4 的濃度和增加了鵬素。其特點(diǎn)是無機(jī)鹽數(shù)量較低，適于生根培養(yǎng)。
    （4）N6培養(yǎng)基   是1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的。其特點(diǎn)是成分較簡單，KNO 3 和（NH 4 ）2SO 4 含量高。在國內(nèi)已廣泛應(yīng)用于小麥、水稻及其他植物的花藥培養(yǎng)和其他組織培養(yǎng)。
    （5）KM-80培養(yǎng)基  它是1974年為原生質(zhì)體培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的。其特點(diǎn)是有機(jī)成分較復(fù)雜，它包括了所有的單糖和維生素，廣泛用于原生質(zhì)融合的培養(yǎng)。

   培養(yǎng)基的選擇

 1、選擇合適的培養(yǎng)基
    選擇合適的培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)成功的基礎(chǔ)。選擇合適的培養(yǎng)基主要從以下兩個(gè)方面考慮：一是基本培養(yǎng)基；二是各種激素的濃度及相對比例。MS培養(yǎng)基適合于大多數(shù)雙子葉植物，B5和N6培養(yǎng)基適合與許多單子葉植物，特別是N6培養(yǎng)基對禾本科植物小麥、水稻等很有效，White培養(yǎng)基適合于根的培養(yǎng)。首先試用這些培養(yǎng)基進(jìn)行初步實(shí)驗(yàn)，可以少走彎路，大大；減少時(shí)間、人力和物力的消耗。當(dāng)通過一系列初試之后，可再根據(jù)實(shí)際情況對其中的某些成分做小范圍調(diào)整。在進(jìn)行調(diào)整時(shí)，以下情況可供參考。一是當(dāng)用一種化合物作為氮源時(shí)，硝酸鹽的作用比銨鹽好，但單獨(dú)使用硝酸鹽會(huì)使培養(yǎng)基的PH向堿性方向漂移，若同時(shí)加入硝酸鹽和少量銨鹽，會(huì)使這種漂移得到克服。二是當(dāng)某些元素供應(yīng)不足時(shí)，培養(yǎng)的植物會(huì)表現(xiàn)出一些癥狀，可根據(jù)癥狀加以調(diào)整，如氮不足時(shí)，培養(yǎng)的組織常表現(xiàn)出花色苷的顏色（紅、紫紅色），愈傷組織內(nèi)部很難看到導(dǎo)管分子的分化；當(dāng)?shù)?、鉀或磷不足時(shí)，細(xì)胞會(huì)明顯過度生長，形成一些十分蓬松，甚至呈透明狀的愈傷組織；鐵、硫缺少時(shí)組織會(huì)失綠，細(xì)胞分裂停滯，愈傷組織出現(xiàn)褐色衰老癥狀；缺硼時(shí)細(xì)胞分裂趨勢緩慢，過度伸長；缺少錳或鉬時(shí)細(xì)胞生長受到影響。培養(yǎng)基外源激素的作用也會(huì)使培養(yǎng)物出現(xiàn)上述一些類似的情況，所以應(yīng)仔細(xì)分析，不可輕易下結(jié)論。

2、激素濃度和相對比例的確定
   組織培養(yǎng)中對培養(yǎng)物影響zui大的是外源激素，在基本培養(yǎng)基確定之后，實(shí)驗(yàn)中要大量進(jìn)行的工作是用不同種類的激素進(jìn)行濃度和各種激素間相互比例的配合試驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)中，首先應(yīng)參考已有的報(bào)道，看是否有用相同植物、相同組織或相近者做過成功或失敗的試驗(yàn)，如果有則可直接作為參考；如果沒有，則在建立激素配比中，將每一種擬使用的激素選擇3-5個(gè)水平，再按隨機(jī)組合的方式建立起如下的實(shí)驗(yàn)方案。
這樣就設(shè)計(jì)出了16種激素配比的實(shí)驗(yàn)方案，即16種不同的培養(yǎng)基。用著16種培養(yǎng)基進(jìn)行初試之后，你會(huì)找到1種或幾種是比較好的。再在這些比較好的組合的基礎(chǔ)上進(jìn)行小范圍的調(diào)整，設(shè)計(jì)出一組新的配方。如在表一中，您認(rèn)為6號培養(yǎng)基較有希望，就可以在此基礎(chǔ)上做出如表二的一組新的設(shè)計(jì)。

表一   兩種激素4種濃度的組合試驗(yàn)

有 16種不同的培養(yǎng)基

表二   第二次激素配比實(shí)驗(yàn)

    有16種不同的培養(yǎng)基

一般來說，經(jīng)過這次實(shí)驗(yàn)就可能選出一種適合于你的實(shí)驗(yàn)材料的培養(yǎng)基，或許不是的，但結(jié)果是可靠的。在此基礎(chǔ)上可進(jìn)行培養(yǎng)基中其他成分的變動(dòng)實(shí)驗(yàn)，如可變動(dòng)蔗糖濃度、瓊脂用量、培養(yǎng)基的 PH或添加某些氨基酸等。但必須掌握一個(gè)原則，就是要有理有據(jù)，特別是對一些寶貴的植物培養(yǎng)材料，更要慎之有慎。

    如果上述試驗(yàn)失敗，那就要做一些更細(xì)致、更麻煩的實(shí)驗(yàn)，花費(fèi)更多的時(shí)間、人力和物力，而且在專業(yè)人員的指導(dǎo)下進(jìn)行，切莫根據(jù)想象來隨意設(shè)計(jì)培養(yǎng)基，這樣成功的概率極小，使寶貴的植物材料丟失，或失去時(shí)機(jī)。

   培養(yǎng)基的配制

配制培養(yǎng)基有兩種方法可以選擇，一是購買培養(yǎng)基中所有化學(xué)藥品，按照需要自己配制；二是購買商品的混合好的培養(yǎng)基基本成分粉劑，如 MS、B5等。
     自己配制可以節(jié)約費(fèi)用，但浪費(fèi)時(shí)間、人力、且有時(shí)由于藥品的質(zhì)量問題，給實(shí)驗(yàn)帶來麻煩。就目前國內(nèi)的情況看，大部分還是自己配制。為了方便起見，現(xiàn)以MS培養(yǎng)基為例介紹配置培養(yǎng)基的主要過程。

1、配制幾種母液
（1）配制MS大量元素母液  
一般將大量元素分別配制成100倍的母液，使用時(shí)再分別稀釋100倍。
分別稱取
NH 4 NO 3           165g               KH 2 PO4              17g
KNO 3                 190g               CaCl 2 ·2H 2 O      44g
MgSO 4 ·7H 2 O     37g
各自配成1L的母液。倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。
（2）配制MS微量元素母液
一般將微量元素配制成100倍母液。
依次稱取
KI                0.083g            Na 2 MoO 4 ·2H 2 O        0.025g
H 3 BO 3              0.62g               CuSO 4 ·5H 2 O          0.0025g
MnSO 4 ·H 2 O        1.69g                CoCl 2 ·6H 2 O             0.0025g
ZnSO 4 ·7H 2 O      0.86g
配成1L母液，倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。
CuSO 4 ·5H 2 O和CoCl 2 ·6H 2 O 由于稱取量很小，如果天平度沒有達(dá)到萬分之一，可先配成調(diào)整液。
分別稱取
CuSO 4 ·5H 2 O            0.05g            CoCl 2 ·6H2O       0.05g
各自配成100ml的調(diào)整液，然后取5ml就還有0.0025g的量。
（3）配制MS有機(jī)母液
一般配制成100倍MS有機(jī)母液。
依次稱取
肌醇    10g            鹽酸硫胺素（VB1）  0.01g
煙酸    0.05g          甘氨酸           0.2g
鹽酸吡哆醇（VB6）      0.05g
配成1L母液，倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。
（4）配制MS鐵鹽母液 
一般配制成100倍MS鐵鹽母液。
依次稱取
EDTA二鈉   3.73g       FeSO4·7H2O    2.78g
配成1L母液，倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。
所以MS母液有5種大量元素母液，加上MS微量元素母液、MS有機(jī)母液和MS鐵鹽母液，共8種母液。

激素母液的配制
各種生長素和細(xì)胞分裂素要單獨(dú)配制，不能混合在一起，生長素類一般要先用少量95%的酒精或1當(dāng)量的NaOH溶解，細(xì)胞分裂素一般要先用1當(dāng)量的鹽酸溶解，然后再加蒸餾水定容。一般取100mg配成100ml母液。

2、配制培養(yǎng)基
以配置1L MS培養(yǎng)基為例，按順序進(jìn)行如下操作：
（1）先在燒杯中放入一些蒸餾水。
（2）分別取上面八種母液10ml倒入。
（3）一般稱取30g蔗糖倒入，攪拌溶解。
（4）加蒸餾水用量筒定溶至1L。
（5）按設(shè)計(jì)好的方案添加各種激素，由于激素的用量很小，而且激素對組培植物的生長至關(guān)重要。所以有條件的話用微量可調(diào)移液器吸取，減少誤差。
（6）用精密試紙或酸度計(jì)調(diào)整PH至5.7-5.8。（有條件的話使用酸度計(jì)，比較）  可配1當(dāng)量的HCL和1當(dāng)量的NaOH用來調(diào)溶液PH值。
1當(dāng)量HCL配制：用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。
1當(dāng)量NaOH配制：稱取NaOH 4g 配成100ml溶液。
（7）稱取5g左右瓊脂粉（質(zhì)量好的瓊脂粉）,倒入上面配好的溶液中，放在電爐上加熱至沸騰，直到瓊脂粉熔化。
（8）稍微冷卻后，分裝入培養(yǎng)容器中。無蓋的培養(yǎng)容器要用封口膜或牛皮紙封口，用橡皮筋或繩子扎緊。
（9）放入消毒滅菌鍋滅菌，滅菌20分鐘左右。
（10）滅菌后從滅菌鍋中取出培養(yǎng)基，平放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上令其冷卻凝固。

      有機(jī)營養(yǎng)成分

有機(jī)營養(yǎng)成分包括維生素、氨基酸或某些有機(jī)混合物。維生素在某些酶系統(tǒng)中有催化作用，加速酶功能的發(fā)揮。硫氨素（維生素 B1）可能是幾乎所有植物都需要的一種維生素，缺少維生素B1時(shí)離體培養(yǎng)的根就不能生長或生長十分緩慢。維生素B1常常以鹽酸鹽的形式即鹽酸硫胺素加入培養(yǎng)基中。鹽酸吡哆醇（維生素B6）和煙酸可能有刺激生長的作用。在細(xì)胞分裂素濃度低于0.1mg/L的情況下特別需要添加維生素B1，在細(xì)胞分裂素濃度高于0.1mg/L時(shí)，煙草細(xì)胞在沒有維生素B1的培養(yǎng)基上亦可緩慢生長，這表明細(xì)胞分裂素可能有誘導(dǎo)植物合成維生素B1的作用。除維生素B1、維生素B6之外，在部分培養(yǎng)基中還添加維生素BX（氨酰苯甲酸）、維生素C（抗壞血酸）、維生素E（生育酚）、維生素H（生物素）、維生素B12（氰鈷胺酸）、維生素BC（葉酸）、維生素B2（核黃素）、泛酸鈣和氯化膽堿等維生素。除葉酸外各種維生素都溶于水，葉酸需要先用少量稀氨水溶解，再加蒸餾水定容。甘氨酸（氨基乙酸）和肌醇（環(huán)己六醇）也是一些培養(yǎng)基的添加成分。另外，在某些植物或某些組織的培養(yǎng)中還加有水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰子汁、玉米胚乳、麥芽浸出物、西紅柿汁和酵母浸出物等。這些可能對某些植物或植物的某些代謝過程有重要作用，如肌醇主要以磷酸肌醇和磷脂酰肌醇的形式參與由Ca介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

無機(jī)營養(yǎng)成分

無機(jī)營養(yǎng)成分就是人們平常所說的礦物質(zhì)、無機(jī)鹽或無機(jī)元素。它們在植物生活中具有非常重要的作用，如氮（ N）、硫（S）、磷（P）是蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸和許多生物催化劑即酶的主要或重要組分。它們與蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸和酶的結(jié)構(gòu)、功能、活性等有直接的*的關(guān)系。氮占蛋白質(zhì)含量的16%-18%，在植物生命活動(dòng)中占有首要的地位，故又稱為生命元素。磷是能量貨幣腺苷三磷酸（ATP）的主要成分之一，與全部生命活動(dòng)緊密相連，在糖代謝、氮代謝、脂肪轉(zhuǎn)變等過程中*。鉀對于參與活體內(nèi)各種重要反應(yīng)的酶起著活化劑的作用，鉀供應(yīng)充分時(shí)糖類合成加強(qiáng)，纖維素和木質(zhì)素含量提高，莖稈堅(jiān)韌，植株健壯。胱氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸等氨基酸中都含有硫，這些氨基酸幾乎是所有蛋白質(zhì)的構(gòu)成分子。鎂離子（Mg 2+ ）是葉綠素分子結(jié)構(gòu)的一部分，缺少鎂，葉綠素就不能形成，葉子就會(huì)失綠，就不能進(jìn)行光合作用。鎂也是染色體的組成成分，在細(xì)胞分裂過程中起作用。鈣是細(xì)胞壁的組分之一，果膠酸鈣是植物細(xì)胞胞間層的主要成分，缺鈣時(shí)細(xì)胞分裂受到影響，細(xì)胞壁形成受阻，嚴(yán)重時(shí)幼芽、幼根會(huì)潰爛壞死?，F(xiàn)代生物學(xué)研究還證明鈣是植物體內(nèi)的信號分子（信使）之一，在植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，鈣離子與鈣調(diào)蛋白結(jié)合形成的Ca2+·CaM復(fù)合體，能活化各種酶，調(diào)節(jié)植物對外界環(huán)境的反應(yīng)與應(yīng)答過程。
       根據(jù)植物對這些元素要量的不同或者根據(jù)目前植物培養(yǎng)基中添加的這些元素量的大小，可將它們分成大量元素和微量元素。大量元素一般指在培養(yǎng)基中的濃度大于0.5mmol/L的元素，微量元素指小于0.5mmol/L的元素。

1、大量元素
     主要包括氮、磷、鉀、鈣、鎂和硫六種。其中，氮常以硝態(tài)氮（NO 3- ）或氨態(tài)氮（NH 4+ ），或兩者相互配合的形式存在。缺氮時(shí)某些植物的愈傷組織會(huì)出現(xiàn)一種很引人注目的花色素苷的顏色，愈傷組織內(nèi)部不能形成導(dǎo)管。鎂常MgSO 4 ·7H 2 O的形式，既提供了鎂也提供了硫。硫還有用Na2SO4的形式提供，不過其中的鈉（Na）對植物并不是必需的，或者說常常是不利的。磷常以NaH 2 PO 4 ·H 2 O,KH 2 PO 4 或（NH 4 ）H 2 PO 4 的形式提供。鉀常以KCl、KNO 3 或KH 2 PO 4 形式。鈣常以CaCl 2 ·2H 2 O、Ca（NO 3 ） 2 ·4H 2 O或其無水形式提供。缺硫時(shí)培養(yǎng)的植物組織會(huì)明顯的退綠；缺磷或鉀時(shí)細(xì)胞會(huì)過度生長，愈傷組織表現(xiàn)出極其蓬松狀態(tài)。

   （1）N   是蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成成分，是生命*的物質(zhì)。在制備培養(yǎng)基時(shí)以硝態(tài)氮（NO 3- ）或氨態(tài)氮（NH 4+ ）兩種形式供應(yīng)。大多數(shù)培養(yǎng)基既含有硝態(tài)氮（NO 3- ）又含有氨態(tài)氮（NH 4+ ）。氨態(tài)氮（NH 4+ ）對植物生長較為有利。供應(yīng)的物質(zhì)有KNO 3 、NH 4 NO 3 等。有時(shí)，也添加氨基酸來補(bǔ)充氮素。
   （2）P   是磷脂的主要成分。而磷脂又是原生質(zhì)、細(xì)胞核的重要組成部分。磷也是ATP、ADP等的組成成分。在植物組織培養(yǎng)過程中，向培養(yǎng)基內(nèi)添加磷，不僅增加養(yǎng)分、提供能量，而且也促進(jìn)對N的吸收，增加蛋白質(zhì)在植物體中的積累。常用的物質(zhì)有KH 2 PO 4 或NaH 2 PO 4 等。
   （3）K   對碳水化合物合成、轉(zhuǎn)移、以及氮素代謝等有密切關(guān)系。K增加時(shí)，蛋白質(zhì)合成增加，維管束、纖維組織發(fā)達(dá)，對胚的分化有促進(jìn)作用。但濃度不易過大，一般為1-3mg/L為好。制備培養(yǎng)基時(shí)，常以KCl、KNO3等鹽類提供。
   （4）Mg、S和Ca、Mg   是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑；S是含S氨基酸和蛋白質(zhì)的組成成分。它們常以MgSO 4 .7H 2 O提供。用量為1-3mg/L較為適宜；Ca是構(gòu)成細(xì)胞壁的一種成分，Ca對細(xì)胞分裂、保護(hù)質(zhì)膜不受破壞有顯著作用，常以CaCl 2 .2H 2 9提供。

2、微量元素
     培養(yǎng)基的微量元素主要包括鐵（Fe）、錳（Mn）、銅（Cu）、鋅（Zn）、氯（Cl）、硼（B）和鉬（Mo）等。這些元素有的對生命活動(dòng)的某個(gè)過程十分有用，有的對蛋白質(zhì)或酶的生物活性十分重要，有的是參與某些生物過程的調(diào)節(jié)。Fe有兩個(gè)重要功能，作為酶的重要組成成分和合成葉綠素所必需，缺鐵時(shí)細(xì)胞分裂停止。Mn對糖酵解中的某些酶有活化作用，是三羧酸循環(huán)中某些酶和硝酸還原酶的活化劑。B能促進(jìn)糖的過膜運(yùn)輸，影響植物的有性生殖如花器官的發(fā)育和受精作用。B還具有抑制有毒的酚類化合物的形成的作用，改善某些植物組織的培養(yǎng)狀況，缺硼時(shí)細(xì)胞分裂停滯，愈傷表現(xiàn)出老化現(xiàn)象。Zn是吲哚乙酸生物合成必需的，也是谷氨酸脫氫酶、乙醇脫氫酶等的活化劑。Cu是細(xì)胞色素氧化酶、多酚氧化酶等氧化酶的成分，可影響氧化還原過程。Mo是硝酸還原酶和鉬鐵蛋白的金屬成分。Cl在光合作用的水光解過程中起活化劑的作用，促進(jìn)氧的釋放和還原NADP（輔酶II）。為了某些植物組織培養(yǎng)的特殊需要有人還把鈉（Na）、鎳（Ni）、鈷（Co）、碘（I）等也加入微量元素的行列。Na對某些鹽生植物、C4植物和景天酸代謝植物是必需的。Ni對尿酸酶（urease）的結(jié)構(gòu)和功能是必需的。但是有些成分的作用至今還不十分清楚，可人們?nèi)匀话阉鼈兗尤肱囵B(yǎng)基中，如碘（I）和鈷（Co）等。鐵是一些氧化酶、細(xì)胞色素氧化酶、過氧化氫酶等的組成成分。同時(shí)，它又是葉綠素形成的必要條件。培養(yǎng)基中的鐵對胚的形成、芽的分化和幼苗轉(zhuǎn)綠有促進(jìn)作用。鐵作為一種微量元素，對植物也是必需的，但由于Fe的特殊性質(zhì)，即很不穩(wěn)定、易沉淀，需要在酸性條件下才能比較穩(wěn)定，故在培養(yǎng)基配制時(shí)常常把Fe鹽單獨(dú)配制，且常以螯合物的形式，把FeSO 4 和它的螯合劑乙二胺四乙酸鈉（Na 2 EDTA）先分別配成溶液，再相互混合使形成螯合鐵，以防沉淀和幫助被植物吸收。但EDTA可能對某些酶系統(tǒng)和培養(yǎng)物的形成發(fā)生有一定的作用，使用時(shí)應(yīng)慎重。
      為了使用方便，無論是大量元素還是微量元素都常常是先配制成母液（即比實(shí)際培養(yǎng)基中的使用濃度高的儲(chǔ)存液），儲(chǔ)存在4度冰箱內(nèi)或在室溫下短期存放。

    總之，植物必需營養(yǎng)元素可組成結(jié)構(gòu)物質(zhì)，也可是具有生理活性的物質(zhì)，如酶、輔酶以及作為酶的活化劑，參與活躍的新陳代謝。此外，在維持離子濃度平衡、膠體穩(wěn)定、電荷平衡等電化學(xué)方面起著重要作用。當(dāng)某些營養(yǎng)元素供應(yīng)不足時(shí)，愈傷組織表現(xiàn)出一定的缺素癥狀。如缺氮，會(huì)表現(xiàn)出一種花色素苷的顏色，不能形成導(dǎo)管；缺鐵，細(xì)胞停止分裂；缺硫，表現(xiàn)出非常明顯的褪綠；卻錳或鉬，則影響細(xì)胞的伸長。
        碳水化合物

      所有的植物組織培養(yǎng)基都需要有碳水化合物作為能源，但當(dāng)培養(yǎng)物通過光合作用提供的CO2能足以維持生長時(shí)可不在培養(yǎng)基上加碳源，這種情況是很少見的。用作碳源的碳水化合物通常為蔗糖或D-葡萄糖，用量通常為2%-4%，高者可達(dá)5%，亦可用市售的白糖所代替，但一般應(yīng)增加用量，而且用比較固定的廠家生產(chǎn)的產(chǎn)品，以保證實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性。在改用一批新的市售白糖時(shí)先做預(yù)試，以防在大量使用時(shí)出現(xiàn)問題，傷害培養(yǎng)材料，造成不必要的損失，因?yàn)槭惺郯滋鞘且环N混合物，成分復(fù)雜且不穩(wěn)定。幾乎所有的培養(yǎng)物在蔗糖作為碳源時(shí)生長都比較好，只有少數(shù)植物或組織在葡萄糖或果糖作為碳源的培養(yǎng)基上生長更合適。也有用麥芽糖、半乳糖、甘露醇、山梨醇和乳糖作為碳源的。蔗糖在經(jīng)高溫滅菌后，會(huì)發(fā)生部分降解，產(chǎn)生D-葡萄糖和D-果糖等，與用過濾法滅菌相比，可能會(huì)出現(xiàn)一些不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但這并不說明高溫滅菌與過濾滅菌哪一種方式更好。如果要進(jìn)行比較嚴(yán)格、的實(shí)驗(yàn)，用過濾法滅菌蔗糖，除此之外在大部分情況下可與培養(yǎng)基一起進(jìn)行高溫滅菌。研究表明蔗糖不僅作為碳源影響到培養(yǎng)物的營養(yǎng)狀況，而且在某些情況下還會(huì)影響到細(xì)胞的分化，如在進(jìn)行葉用萵苣的髓細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，誘導(dǎo)木質(zhì)部分化的適宜濃度為2g/L，但要讓木質(zhì)部進(jìn)一步發(fā)育則再提高蔗糖濃度，這樣才能更有利于木質(zhì)部的形成。木質(zhì)部成分的分化，特別是管胞分子的分化形成，往往是器官發(fā)生的先決條件。

    蔗糖、葡萄糖、白糖等的純度問題，現(xiàn)在也引起人們的注意，因?yàn)樵诮Y(jié)晶時(shí)，它們往往包藏有恒量的有機(jī)物如氨基酸等，這些雖然不會(huì)使實(shí)驗(yàn)受到很大影響，但有時(shí)可能影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，在使用時(shí)應(yīng)稍加留神。

    糖的種類和用量是植物組織培養(yǎng)能否成功的重要因素之一。蔗糖的作用具有普遍性和廣泛性，這一點(diǎn)已無人懷疑。近年來，其它糖類在植物組織培養(yǎng)中的作用引起很大關(guān)注。在淀粉作為凝固劑的培養(yǎng)基中加入12%蜜二糖，比只加8%蔗糖的大麥花粉培養(yǎng)基產(chǎn)生胚狀體的頻率高35倍，可高達(dá)40%。乳糖、麥芽糖、半乳糖和甘油均可顯著促進(jìn)培養(yǎng)的柑橘的胚狀體發(fā)生。麥芽糖、麥芽浸出物和果糖對苜蓿胚狀體發(fā)生的促進(jìn)作用均大于蔗糖。葡萄糖、果糖、甘露糖、核糖和蔗糖對培養(yǎng)的煙草原生質(zhì)體再生都有促進(jìn)作用，半乳糖則有抑制作用。麥芽糖可明顯提高培養(yǎng)的大麥花藥的綠苗產(chǎn)率，而蔗糖、果糖和葡萄糖單獨(dú)或麥芽糖混合使用，均不利胚狀體的生長。

   植物生長調(diào)節(jié)劑

 植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)是一些調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的物質(zhì)。植物生長物質(zhì)可分為兩類：一類是植物激素；另一類是植物生長調(diào)節(jié)劑。植物激素是指自然狀態(tài)下植物體內(nèi)合成，并從產(chǎn)生處運(yùn)送到別處，對生長發(fā)育產(chǎn)生顯著作用的微量（1微摩爾/升以下）有機(jī)物；植物生長調(diào)節(jié)劑是指一些具有植物激素活性的人工合成的物質(zhì)。但在平常工作中人們并沒有將它們嚴(yán)格區(qū)分開來，而籠統(tǒng)稱之為“激素”、“植物激素”或“植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)”。這類物質(zhì)既可以刺激植物生長，也可以抑制植物的生長，對植物的生命活動(dòng)真正起到調(diào)節(jié)作用。在植物組織培養(yǎng)中使用的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)主要有生長素類和細(xì)胞分裂素類兩大類，少數(shù)培養(yǎng)基中還添加赤霉素GA3等。

1、生長素
   生長素在植物體中的合成部位是葉原基、嫩葉和發(fā)育中的種子。成熟葉片和根尖也產(chǎn)生很微量的生長素。在植物組織培養(yǎng)中，生長素主要被用做誘導(dǎo)刺激細(xì)胞分裂和根的分化。在植物組織培養(yǎng)中常用的生長素有：NAA（萘乙酸）、IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸）、NOA（萘氧乙酸），P-CPA（對氯苯氧乙酸）、2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸），2，4，5-T（2，4，5-三氯苯氧乙酸）等。NAA有 α -和β-兩種形式，是由人工合成的，培養(yǎng)基中總是用α-型，所以在配制培養(yǎng)基時(shí)總是說加α-萘乙酸。與IBA相比，NAA誘發(fā)根的能力較弱，誘發(fā)的根少而粗，但對某些植物如楊樹等卻具有很好的效果，IBA在根的誘導(dǎo)與生長上作用強(qiáng)烈，作用時(shí)間長，誘發(fā)的根多而長，特別有效，但也不可一概而論。IBA是天然合成的生長素，可被光迅速溶解或被酶所氧化，由于培養(yǎng)基中可能有氧化酶存在，所以在使用濃度上應(yīng)相對較高（1-30mg/L）。對愈傷組織增殖zui有效的是2，4-D，特別是對單子葉植物，10-7-10-5mol/L即可以誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷，常常不需再加細(xì)胞分裂素。但2，4-D是一種極有效的器官發(fā)生抑制劑，不能用于啟動(dòng)根和芽分化的培養(yǎng)基中。

2、細(xì)胞分裂素
   細(xì)胞分裂素是腺嘌呤（adnine,也叫6-氨基嘌呤的衍生物。腺嘌呤的第6為氨基、第2位碳原子和第9位氮原子上的氫原子可以被不同的基團(tuán)所取代，當(dāng)被取代時(shí)就會(huì)形成各種不同的細(xì)胞分裂素，因此，確切的講應(yīng)該叫細(xì)胞分裂素類物質(zhì)。植物和微生物中都含有細(xì)胞分裂素。細(xì)胞分裂素在植物生長發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均可表現(xiàn)出它的調(diào)節(jié)作用，由于它是一種腺嘌呤的衍生物，所以人們聯(lián)想到它的調(diào)節(jié)作用，由于它的調(diào)節(jié)作用可能對核酸的影響有關(guān)。它可以影響某些酶的活性，可以影響植物體內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸，可以調(diào)控細(xì)胞器的發(fā)生，還可以打破某些植物種子的休眠和延緩葉片的衰老?，F(xiàn)代生物學(xué)研究初步證明，細(xì)胞分裂素可以結(jié)合到高等植物的核糖核蛋白體上，促進(jìn)核糖體與mRNA的結(jié)合，加快翻譯速度，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的生物合成。它還可以與細(xì)胞膜和細(xì)胞核結(jié)合，影響細(xì)胞的分裂、生長與分化。在tRNA分子的反密碼子附近發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞分裂素的結(jié)合位點(diǎn)，這可能預(yù)示著細(xì)胞分裂素在基因表達(dá)的翻譯水平上具有調(diào)節(jié)作用，其實(shí)，細(xì)胞分裂素本身就是rRNA的組成部分，植物tRNA中的細(xì)胞分裂素就有異戊烯基腺苷、反式玉米素核苷、甲硫基異戊烯基腺苷和甲硫基玉米素核苷等數(shù)種。
    自然情況下，細(xì)胞分裂素主要在根中合成，但根并不是*的合成部位，莖端、萌發(fā)中的種子、發(fā)育中的果實(shí)和種子也能合成。
    在組織培養(yǎng)中使用細(xì)胞分裂素的主要目的是刺激細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)芽的分化、葉片擴(kuò)大和莖長高，抑制根的生長。培養(yǎng)基中經(jīng)常使用的天然的細(xì)胞分裂素主要有：從甜玉米未成熟種子或其他植物中分離到的玉米素[6-（4-羥基-3-甲基-反式-2-丁烯氨基）嘌呤]。人工合成的細(xì)胞分裂素主要有激動(dòng)素（KT，6-呋喃氨基嘌呤）、6-芐基腺嘌呤（6-BA）、2IP（異戊烯氨基嘌呤）和TDZ（thidiazuron,噻二唑苯基脲）等。細(xì)胞分裂素常常與生長素相互配合，用以調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂，細(xì)胞伸長，細(xì)胞分化和器官形成。

3、赤霉素
   主要是GA3，雖然已經(jīng)用于頂端分生組織的培養(yǎng)和維管分化的研究，但在培養(yǎng)基中很少添加，因?yàn)樗淖饔猛秦?fù)面的。雖然也有赤霉素能刺激不定胚發(fā)育成正常小植株的報(bào)道，但在使用中仍需慎重，不可輕易添加。如果想在實(shí)驗(yàn)中添加赤霉素，則必須先用一些不重要的材料做預(yù)試，待獲得肯定結(jié)果時(shí)再用于正式實(shí)驗(yàn)。

4、乙烯
   乙烯的作用逐漸引起重視，它在芽的誘導(dǎo)和管胞分化上具有一定作用，管胞分化往往又是器官發(fā)生的基礎(chǔ)。乙烯單獨(dú)地或與CO2共同加入瓶中以代替BA或BA+2，4-D的作用，促進(jìn)水稻愈傷組織芽的生長，CO2對乙烯促芽的促進(jìn)作用明顯，AgNO3可逆轉(zhuǎn)乙烯和2，4-D的抑制作用，促進(jìn)小麥愈傷組織生芽。在有IAA和KT時(shí)乙烯促進(jìn)Wigitalis obscura芽的形成。乙烯對芽形成的這種相對獨(dú)立的效果不只是因?yàn)榉N的差異，也與不同發(fā)育時(shí)期植物對乙烯的敏感性不同有關(guān)。如煙草的組織隨著培養(yǎng)時(shí)間而對乙烯的敏感性有變化，在培養(yǎng)早期促進(jìn)芽的發(fā)端，后期則起抑制作用。溫度可以影響乙烯的產(chǎn)生量，25-35℃下產(chǎn)生量較高，可促進(jìn)水稻培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生根，15℃或40℃下產(chǎn)生量降低，不生根。番茄葉圓片培養(yǎng)時(shí)，乙烯抑制IAA誘導(dǎo)的生根。一般說來，依稀抑制體細(xì)胞胚胎發(fā)生，非胚性愈傷組織比胚性愈傷組織產(chǎn)生更多的乙烯。在懸浮培養(yǎng)中，乙烯對細(xì)胞的指數(shù)生長期有雙向作用。由于乙烯是一種簡單的不飽和碳?xì)浠衔?，在生理環(huán)境的溫度和壓力下，是一種氣體，比空氣輕，實(shí)驗(yàn)中很難掌握用量，所以一般不使用。高等植物各器官都能產(chǎn)生乙烯，但不同組織、不同器官和不同發(fā)育時(shí)期，乙烯的釋放量不同。在組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)的植物組織也會(huì)產(chǎn)生乙烯，如果封口用的是不透氣的塑料膜，容器內(nèi)就會(huì)逐漸積累乙烯，嚴(yán)重時(shí)可引起培養(yǎng)物的死亡。培養(yǎng)瓶內(nèi)乙烯的積累量因植物種類而不同，小麥的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物24H中每克干重可產(chǎn)生乙烯5nmol,水稻的為6nmol，亞麻的可高達(dá)900nmol。煙草的愈傷組織產(chǎn)生的乙烯量比胡蘿卜的高400倍。

   瓊脂或其他支持物

  除液體懸浮培養(yǎng)外，所有的培養(yǎng)物都應(yīng)生長在固定或半固定的培養(yǎng)基上以防止培養(yǎng)物沉入液體培養(yǎng)基，因缺氧而死亡。就目前情況而言，瓊脂是一種極為理想的支持物。它是由海藻得來的多糖類物質(zhì)，但并不是培養(yǎng)基中的必需成分，只是作為一種凝固膠黏劑使培養(yǎng)基變成固體或半固體狀態(tài)，以支撐培養(yǎng)物，雖然瓊脂只是作為一種膠連物，但由于其生產(chǎn)方式和廠家不同而可能含有數(shù)量和種類不等的雜質(zhì)，如Ca、Mg、Fe、硫酸鹽等，從而可能影響到培養(yǎng)效果或某些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。在選擇瓊脂時(shí)，固定廠家，但國內(nèi)尚沒有一個(gè)比較穩(wěn)固的生產(chǎn)廠家提供瓊脂。雖然市售的瓊脂或瓊脂條價(jià)格便宜，可以使用，但其帶來的潛在副作用可能是組培失敗或中途夭折的主要原因。建議在經(jīng)濟(jì)條件允許的情況下，建議買進(jìn)口、固定廠家的商品。瓊脂的使用濃度取決于培養(yǎng)目的，使用的瓊脂性能（胨力張度、灰分、熱水中不溶物、粗蛋白等）等因素，一般濃度為0.4%-1%，質(zhì)量越差的瓊脂用量越大。除瓊脂外，為了更好的調(diào)控培養(yǎng)物的生長，現(xiàn)在發(fā)展的趨勢是使用一種含有瓊脂的混合物作為固體膠連劑，如Sigma公司生產(chǎn)的Agargel就是用瓊脂和Phytagl混合在一起的一種新型膠連劑，可以用來控制培養(yǎng)物的玻璃化。

    培養(yǎng)基中添加瓊脂使培養(yǎng)基呈固體或半固體狀態(tài)，使培養(yǎng)物能夠處于表面，既能吸收必需的養(yǎng)分、水分，又可不致因缺氧而死亡。但固體或半固體狀態(tài)，一方面限制了培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分和水的移動(dòng)；另一方面也限制了培養(yǎng)的植物組織分泌物，特別是有毒代謝產(chǎn)物的擴(kuò)散，使有培養(yǎng)物周圍的營養(yǎng)成分逐漸匱乏，代謝產(chǎn)物逐漸積累，植物生長受阻或受到毒害。為了解決這個(gè)問題，人們試驗(yàn)使用其他支持物來代替瓊脂。濾紙橋法即是一種，該法是將一張較厚的濾紙折疊成M型，放入液體培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)的植物組織放在M的中間凹陷處，這樣培養(yǎng)物可通過濾紙的虹吸作用不斷吸收營養(yǎng)和水分，又可保持有足夠的氧氣。在此基礎(chǔ)上，又發(fā)展出了一種類似與“看護(hù)”培養(yǎng)的方法，即在濾紙橋的中間凹陷處加一種固體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基中也可混有分散的植物細(xì)胞團(tuán)，將材料放在固體培養(yǎng)基上，再把濾紙放入另一種液體培養(yǎng)基中，用兩種不同的培養(yǎng)基同時(shí)培養(yǎng)材料，可收到較好的效果?，F(xiàn)在也有用玻璃纖維濾器或人工合成的聚酯羊毛代替瓊脂的試驗(yàn)中人們或許能受到一些啟發(fā)，即培養(yǎng)基中添加瓊脂的目的主要是為了支持培養(yǎng)物，只要達(dá)到這個(gè)目的，可選用不同的材料和方法進(jìn)行代替瓊脂的試驗(yàn)。需要考慮的主要問題是，這種材料必須無毒害作用，且不被培養(yǎng)的植物組織所吸收，不與培養(yǎng)液成分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。

    瓊脂作為支持物或凝固劑對絕大部分植物都是有利的或者說是無害的，但也有一些報(bào)道說瓊脂對某些培養(yǎng)物不利。在馬鈴薯、胡蘿卜、煙草、小麥等作物組培中，均發(fā)現(xiàn)以淀粉代替瓊脂更有利于培養(yǎng)物的生長和分化。但是，目前情況下還沒有哪種支持物比瓊脂更*。
        其他添加劑

為了特殊的培養(yǎng)目的，在一部分培養(yǎng)基中還添加了一些特殊成分，如水解酪蛋白，水解乳蛋白，甲硫氨酸（蛋氨酸）， L-酪氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸等氨基酸，酵母提取物，胰蛋白胨，椰乳，西紅柿汁，香蕉粉，橘子汁，可可汁，活性炭，滲透調(diào)節(jié)劑等。添加少量甲硫氨酸有促進(jìn)乙烯合成和刺激木質(zhì)部發(fā)生的作用，但添加多種氨基酸后往往有制止生長的作用，這可能是由于各種氨基酸之間的相互競爭而引起的。對天然提取物的應(yīng)用雖然有不同觀點(diǎn)，有的主張使用，有的主張不使用，因?yàn)槠錉I養(yǎng)成分和作用無法弄明白，但在用已知化學(xué)物質(zhì)無法達(dá)到目的時(shí)，適當(dāng)使用一些天然混合物，的確使一些用常規(guī)培養(yǎng)方法沒有獲得愈傷或不能誘導(dǎo)再生的植物產(chǎn)生了愈傷和分化形成植株。

1、活性炭
       活性炭為木炭粉碎經(jīng)加工形成的粉末結(jié)構(gòu)，它結(jié)構(gòu)疏松、孔隙大，吸水力強(qiáng)，有很強(qiáng)的吸附作用，它的顆粒大小決定著吸附能力。粒度越小，吸附能力越大。溫度低吸附能力強(qiáng)，溫度高吸附能力弱，甚至解吸附。通常使用濃度為0.5-10g/L。它可以吸附非極性物質(zhì)和色素等大分子物質(zhì)，包括瓊脂中所含的雜質(zhì)，培養(yǎng)物分泌的酚、醌類物質(zhì)以及蔗糖在高壓消毒時(shí)產(chǎn)生的5-羥甲基糖醛及激素等。
    莖尖初代培養(yǎng)，假如適量活性炭，可以吸附外植體產(chǎn)生的致死性褐化物，其效力優(yōu)于VC和半胱氨酸；在新梢增殖階段，活性炭可明顯促進(jìn)新梢的形成和伸長，但其作用有一個(gè)閥值，一般為0.1%-0.25，不能超過0.2%。
    活性炭在生根時(shí)有明顯的促進(jìn)作用，其機(jī)理一般認(rèn)為與活性炭減弱光照有關(guān)，可能是由于根頂端產(chǎn)生促進(jìn)根生長的IAA，但I(xiàn)AA易受可見光的光氧化而破壞，因此活性炭的主要作用就在于通過減弱光照保護(hù)了IAA，從而間接促進(jìn)了根的生長，由于根的生長加快，吸收能力增強(qiáng)，反過來又促進(jìn)了莖、葉的生長。
    此外，在培養(yǎng)基中加入0.3%活性炭，還可降低玻璃苗的產(chǎn)生頻率，對防止產(chǎn)生玻璃苗有良好作用。
    活性炭在胚胎培養(yǎng)中也有一定作用，如在葡萄胚珠培養(yǎng)時(shí)向培養(yǎng)基加入0.1%的活性炭，可減少組織變褐和培養(yǎng)基變色，產(chǎn)生較少的愈傷組織。
    但是，活性炭具有副作用，研究表示，每毫克的活性炭能吸附100ng左右的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，這說明只需要極少量的活性炭就可以*吸附培養(yǎng)基中調(diào)節(jié)物質(zhì)。大量的活性炭加入會(huì)削弱瓊脂的凝固能力，因此要多加一些瓊脂。很細(xì)的活性炭也易沉淀，通常在瓊脂凝固之前，要輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶?？傊欠N隨意抓一撮活性炭放入培養(yǎng)基，會(huì)帶來不良的后果。因此，在使用時(shí)要有其量的意識，使活性炭發(fā)揮其積極作用。
    也許是由于活性炭的存在使培養(yǎng)基變黑，產(chǎn)生了類似于土壤的效果，以利于植物的生長。還有報(bào)道指出，活性炭有刺激胚胎發(fā)生或組織生長和形態(tài)發(fā)生的作用?；钚蕴縼碓吹牟煌部赡苁顾鸬淖饔貌煌?，如木材活性炭比骨質(zhì)活性炭含有更多的碳，而骨質(zhì)活性炭中含有的混合物可能對培養(yǎng)物有副作用。

2、滲透調(diào)節(jié)劑
      植物細(xì)胞對水的吸收受到其所含液泡與培養(yǎng)基之間的相對水勢所控制。培養(yǎng)基中影響水分利用的主要成分是瓊脂的百分含量，蔗糖的含量和添加的一些用于調(diào)節(jié)滲透壓的非代謝物。滲透調(diào)節(jié)劑往往是選用一些代謝微弱的糖來充當(dāng)，如甘露（糖）醇、山梨醇和聚乙二醇等，這些糖基本上不被培養(yǎng)的植物組織所吸收，而只存留在培養(yǎng)基中，起到調(diào)節(jié)滲透的作用。

3、抗生素
     培養(yǎng)的植物組織，很容易發(fā)生細(xì)菌或真菌污染。引起的原因是多方面的，有的是消毒不*，有的是無菌操作過程中器皿或操作人員不注意，有的是消毒不*，有的是無菌操作過程中器皿或操作人員不注意，有的是培養(yǎng)過程中由于蓋培養(yǎng)容器的蓋子破損或沒扎緊，有的是培養(yǎng)的植物組織內(nèi)部攜帶有病原物，表面消毒不解決問題。污染會(huì)給組培工作帶來很大影響或損失，尤其是已經(jīng)培養(yǎng)一段時(shí)間的材料在發(fā)生；污染所造成的損失更大。為了解決或防止這個(gè)問題，可在配置培養(yǎng)基時(shí)添加抗生素，比如加200-300U的慶大霉素可使細(xì)菌污染受到很好的控制，濃度超過600U時(shí)可在一定程度上抑制分化，但這種抑制作用可在除去慶大霉素后異端時(shí)間內(nèi)得到恢復(fù)。

4、抗氧化劑
   植物組織在初割時(shí)會(huì)溢泌一些酚類物質(zhì)，接觸空氣中的氧氣后，自動(dòng)氧化或由酶類催化氧化為相應(yīng)的醌類，產(chǎn)生可見的茶色、褐色以致黑色，這就是酚污染。這些物質(zhì)滲出細(xì)胞外就造成自身中毒，使培養(yǎng)的材料生長停頓，失去分化能力可，zui終變褐色死亡。在木本，尤其是熱帶木本及少數(shù)草本植物中較為嚴(yán)重。目前還沒有*完善的辦法，只能按不同的實(shí)際情況，加用一些藥物，并適當(dāng)降低培養(yǎng)溫度、及時(shí)轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上等辦法，使之有不同程度的緩解，當(dāng)然像嚴(yán)格選擇外植體部位，加大接種數(shù)量等也應(yīng)一并考慮。
    抗酚類氧化常用的藥劑有半胱氨酸及VC，可用50-200mg/L的濃度洗滌剛切割的外植體傷口表面，或過濾滅菌后假入固體培養(yǎng)基的表層。其他抗氧化劑有二硫蘇糖醇、谷胱甘肽、硫乙醇、及二乙基二硫氨基甲酸酯。

5、椰乳   
   是椰子的液體胚乳。它是使用zui多、效果zui大的一種天然復(fù)合物。一般使用濃度在10%-20%，與其果實(shí)成熟度及產(chǎn)地關(guān)系也很大。它在愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)中有促進(jìn)作用。在馬鈴薯莖尖分生組織很草莓微莖尖培養(yǎng)中起明顯的促進(jìn)作用，但莖尖組織的大小若超過1mm時(shí)，椰乳就不發(fā)生作用。

6、香蕉
   用量為150-200ml/L。用黃熟的小香蕉，加入培養(yǎng)基后變?yōu)樽仙?。對PH值的緩沖作用大。主要在蘭花的組織培養(yǎng)中應(yīng)用，對發(fā)育有促進(jìn)作用。

7、馬鈴薯 
   去掉皮和芽后，加水煮30分鐘，再經(jīng)過過濾，取其濾液使用。用量為150-200g/L。對PH值緩沖作用也大。添加后可得到健壯的植株。

8、水解酪蛋白
   為蛋白質(zhì)的水解物，主要成分為氨基酸，使用濃度為100-200mg/L。受酸和酶的作用易分解，使用時(shí)要注意。

9、其他
   酵母提取物（YE）（0.01%-0.05%），主要成分為氨基酸和維生素類；麥芽提取物（0.01%-0.5%）、蘋果和番茄的果汁、黃瓜的果實(shí)、未熟玉米的胚乳等。遇熱較穩(wěn)定，大多在培養(yǎng)困難時(shí)使用，有時(shí)有效。

培養(yǎng)基的配制

配制培養(yǎng)基有兩種方法可以選擇，一是購買培養(yǎng)基中所有化學(xué)藥品，按照需要自己配制；二是購買商品的混合好的培養(yǎng)基基本成分粉劑，如 MS、B5等。
     自己配制可以節(jié)約費(fèi)用，但浪費(fèi)時(shí)間、人力、且有時(shí)由于藥品的質(zhì)量問題，給實(shí)驗(yàn)帶來麻煩。就目前國內(nèi)的情況看，大部分還是自己配制。為了方便起見，現(xiàn)以MS培養(yǎng)基為例介紹配置培養(yǎng)基的主要過程。

1、配制幾種母液
（1）配制MS大量元素母液  
一般將大量元素分別配制成100倍的母液，使用時(shí)再分別稀釋100倍。
分別稱取
NH 4 NO 3           165g               KH 2 PO4              17g
KNO 3                 190g               CaCl 2 ·2H 2 O      44g
MgSO 4 ·7H 2 O     37g
各自配成1L的母液。倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。
（2）配制MS微量元素母液
一般將微量元素配制成100倍母液。
依次稱取
KI                     0.083g            Na 2 MoO 4 ·2H 2 O        0.025g
H 3 BO 3              0.62g               CuSO 4 ·5H 2 O          0.0025g
MnSO 4 ·H 2 O        1.69g                CoCl 2 ·6H 2 O             0.0025g
ZnSO 4 ·7H 2 O      0.86g
配成1L母液，倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。
CuSO 4 ·5H 2 O和CoCl 2 ·6H 2 O 由于稱取量很小，如果天平度沒有達(dá)到萬分之一，可先配成調(diào)整液。
分別稱取
CuSO 4 ·5H 2 O            0.05g            CoCl 2 ·6H2O       0.05g
各自配成100ml的調(diào)整液，然后取5ml就還有0.0025g的量。
（3）配制MS有機(jī)母液
一般配制成100倍MS有機(jī)母液。
依次稱取
肌醇    10g            鹽酸硫胺素（VB1）  0.01g
煙酸    0.05g          甘氨酸           0.2g
鹽酸吡哆醇（VB6）      0.05g
配成1L母液，倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。
（4）配制MS鐵鹽母液 
一般配制成100倍MS鐵鹽母液。
依次稱取
EDTA二鈉   3.73g       FeSO4·7H2O    2.78g
配成1L母液，倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。
所以MS母液有5種大量元素母液，加上MS微量元素母液、MS有機(jī)母液和MS鐵鹽母液，共8種母液。

激素母液的配制
各種生長素和細(xì)胞分裂素要單獨(dú)配制，不能混合在一起，生長素類一般要先用少量95%的酒精或1當(dāng)量的NaOH溶解，細(xì)胞分裂素一般要先用1當(dāng)量的鹽酸溶解，然后再加蒸餾水定容。一般取100mg配成100ml母液。

2、配制培養(yǎng)基
以配置1L MS培養(yǎng)基為例，按順序進(jìn)行如下操作：
（1）先在燒杯中放入一些蒸餾水。
（2）分別取上面八種母液10ml倒入。
（3）一般稱取30g蔗糖倒入，攪拌溶解。
（4）加蒸餾水用量筒定溶至1L。
（5）按設(shè)計(jì)好的方案添加各種激素，由于激素的用量很小，而且激素對組培植物的生長至關(guān)重要。所以有條件的話用微量可調(diào)移液器吸取，減少誤差。
（6）用精密試紙或酸度計(jì)調(diào)整PH至5.7-5.8。（有條件的話使用酸度計(jì)，比較）  可配1當(dāng)量的HCL和1當(dāng)量的NaOH用來調(diào)溶液PH值。
1當(dāng)量HCL配制：用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。
1當(dāng)量NaOH配制：稱取NaOH 4g 配成100ml溶液。
（7）稱取5g左右瓊脂粉（質(zhì)量好的瓊脂粉）,倒入上面配好的溶液中，放在電爐上加熱至沸騰，直到瓊脂粉熔化。
（8）稍微冷卻后，分裝入培養(yǎng)容器中。無蓋的培養(yǎng)容器要用封口膜或牛皮紙封口，用橡皮筋或繩子扎緊。
（9）放入消毒滅菌鍋滅菌，滅菌20分鐘左右。
（10）滅菌后從滅菌鍋中取出培養(yǎng)基，平放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上令其冷卻凝固。

滅菌

     滅菌是組織培養(yǎng)重要的工作之一。初學(xué)者要清楚有菌和無菌的范疇。有菌的范疇是：凡是暴露在空氣中的物體，接觸自然水源的物體，至少它的表面都是有菌的。依此觀點(diǎn)，無菌室等未處理的地方、超凈臺(tái)的表面、簡單煮沸的培養(yǎng)基、我們使用的刀、剪在未處理之前、我們身體的整個(gè)外表及與外界相連的內(nèi)表，如整個(gè)消化道、呼吸道，即我們呼出的氣體、培養(yǎng)容器無論洗得多干凈等等都是有菌的。
     這里所指的菌，包括細(xì)菌、真菌、放線菌、藻類及其他微生物。菌的特點(diǎn)是：極小，肉眼看不見。無處不在，無時(shí)不有，*。在自然條件下忍耐力強(qiáng)，生活條件要求簡單，繁殖力*，條件適宜時(shí)便可大量滋生。
     無菌的范疇是：經(jīng)高溫灼燒或一定時(shí)間蒸煮過后的物體，經(jīng)其他物理或化學(xué)的滅菌方法處理后的物體（當(dāng)然這些方法必須已經(jīng)證明是有效的），高層大氣、巖石內(nèi)部、健康的動(dòng)、植物的不與外部接觸的組織內(nèi)部，強(qiáng)酸強(qiáng)堿，化學(xué)元素滅菌劑等表面和內(nèi)部都是無菌的。從以上可以看出：在地球表面無菌世界要比有菌世界小的多。
     滅菌是指用物理或化學(xué)的方法，殺死物體表面和孔隙內(nèi)的一切微生物或生物體，即把所有生命的物質(zhì)全部殺死。與此相關(guān)的一個(gè)概念是消毒，它指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用，顯然經(jīng)過消毒，許多細(xì)菌芽孢、霉菌厚垣孢子等不會(huì)*殺死，即由于在消毒后的環(huán)境里和物品上還有活著的微生物，所以通過嚴(yán)格滅菌的操作空間（接種、超凈臺(tái)等）和使用的器皿，以及操作者的衣著和手都不帶任何活著的微生物。在這樣的條件下進(jìn)行的操作，就叫做無菌操作。
     植物組織培養(yǎng)對無菌條件的要求是非常嚴(yán)格的，甚至超過微生物的培養(yǎng)要求，這是因?yàn)榕囵B(yǎng)基含有豐富的營養(yǎng)，稍不小心就引起雜菌污染。要達(dá)到*滅菌的目的，必須根據(jù)不同的對象采取不同的切實(shí)有效的方法滅菌，才能保證培養(yǎng)時(shí)不受雜菌的影響，使試管苗能正常生長。
    常用的滅菌方法可分為物理的和化學(xué)的兩類，即：物理方法如干熱（烘燒和灼燒）、濕熱（常壓或高壓蒸煮）、射線處理（紫外線、超聲波、微波）、過濾、清洗和大量無菌水沖洗等措施；化學(xué)方法是使用升汞、甲醛、過氧化氫、高錳酸鉀、來蘇水、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學(xué)藥品處理。這些方法和藥劑要根據(jù)工作中的不同材料不同目的適當(dāng)選用。

    1、培養(yǎng)基用濕熱滅菌
    培養(yǎng)基在制備后的24小時(shí)內(nèi)完成滅菌工序。高壓滅菌的原理是：在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸汽不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點(diǎn)不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在0.1MPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達(dá)121℃。在此蒸汽溫度下，可以很快殺死各種細(xì)菌及其高度耐熱的芽孢。
    注意*排除鍋內(nèi)空氣，使鍋內(nèi)全部是水蒸氣，滅菌才能*。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法，但目的都是要排凈空氣，使鍋內(nèi)均勻升溫，保證滅菌*。常用方法是：關(guān)閉放氣閥，通電后，待壓力上升到0.05MPa時(shí)，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關(guān)閉放氣閥。
    關(guān)閥再通電后，壓力表上升達(dá)到0.1MPa時(shí)，開始計(jì)時(shí)，維持壓力0.1-0.15MPa，20分鐘。
    按容器大小不同，保壓時(shí)間有所不同，見表。該表所列數(shù)字是*滅菌很保險(xiǎn)的數(shù)字，如果容器體積較大，但是放置的數(shù)量很少，也可以減少時(shí)間。

培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌所必需的zui少時(shí)間

     到達(dá)保壓時(shí)間后，即可切斷電源，在壓力到0.5MPa，可緩慢放出蒸汽，應(yīng)注意不要使壓力降低太快，以致引起激烈的減壓沸騰，使容器中的液體四溢。當(dāng)壓力降到零后，才能開蓋，取出培養(yǎng)基，擺在平臺(tái)上，以待冷凝。不可久不放氣，引起培養(yǎng)基成分變化，以至培養(yǎng)基無法擺斜面。一旦放置過久，由于鍋爐內(nèi)有負(fù)壓，蓋子打不開，只要將放氣閥打開，大氣壓入，內(nèi)外壓力平衡，蓋子便易打開了。
    對高壓滅菌后不變質(zhì)的物品，如無菌水、栽培介質(zhì)、接種工具，可以延長滅菌時(shí)間或提高壓力。而培養(yǎng)基要嚴(yán)格遵守保壓時(shí)間，既要保壓*，又要防止培養(yǎng)基中的成分變質(zhì)或效力降低，不能隨意延長時(shí)間。
     對于一些布制品，如實(shí)驗(yàn)衣、口罩等也可用高壓滅菌。洗凈晾干后用耐高壓塑料袋裝好，高壓滅局20-30分鐘。
     高壓滅菌前后的培養(yǎng)基，其PH值下降0.2-.3單位。高壓后培養(yǎng)基PH值的變化方向和幅度取決于多種因素。在高壓滅菌前用堿調(diào)高PH值至預(yù)定值的則相反。培養(yǎng)基中成分單一時(shí)和培養(yǎng)基中含有高或較高濃度物質(zhì)時(shí)，高壓滅菌后的PH值變化幅度較大，甚至可大于2個(gè)PH值單位。環(huán)境PH值的變化大于0.5單位就有可能產(chǎn)生明顯的生理影響。
     高壓滅菌通常會(huì)使培養(yǎng)基中的蔗糖水解為單糖，從而改變培養(yǎng)基的滲透壓。在8%-20%蔗糖范圍內(nèi)，高壓滅菌后的培養(yǎng)基約升高0.43倍。
     培養(yǎng)基中的鐵在高壓滅菌時(shí)會(huì)催化蔗糖水解，可使15%-25%的蔗糖水解為葡萄糖和果糖。培養(yǎng)基值小于5.5，其水解量更多，培養(yǎng)基中添加0.1%活性炭時(shí)，高壓下蔗糖水解大大增強(qiáng)，添加1%活性炭，蔗糖水解率可達(dá)5%。
     為防止高壓滅菌產(chǎn)生的上訴一些變化可用下列方法：
    （1）經(jīng)常注意搜集有關(guān)高壓滅菌影響培養(yǎng)基成分的資料，以便及時(shí)采取有效措施。
    （2）設(shè)計(jì)培養(yǎng)基配方時(shí)盡量采用效果類似的穩(wěn)定試劑并準(zhǔn)確掌握劑量。如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇，以IBA代替IAA，控制活性炭的用量（在0.1%以下）注意PH值對高壓滅菌下培養(yǎng)基中成分的影響等。
    （3）配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)注意成分的適當(dāng)分組與加入的順序。如將磷、鈣和鐵放在zui后加入。
    （4）注意高壓滅菌后培養(yǎng)基PH值的變化及回復(fù)動(dòng)態(tài)。如高壓滅菌后的PH值常由5.8升高至6.48。而96小時(shí)后又回降至5.8左右。這樣在實(shí)驗(yàn)中就可以根據(jù)這一規(guī)律加以掌握。

    2、用于無菌操作的器械采用灼燒滅菌
    在無菌操作時(shí)，把鑷子、剪刀、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精燈火焰上灼燒滅菌。冷卻后，立即使用。操作中可采用250或500毫升的廣口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。

    3、玻璃器皿及耐熱用具采用干熱滅菌
    干熱滅菌是利用烘箱加熱到160-180℃的溫度來殺死微生物。由于在干熱條件下，細(xì)菌的營養(yǎng)細(xì)胞的抗熱性大為提高，接近芽孢的抗熱水平，通常采用170℃持續(xù)90分鐘來滅菌。干熱滅菌的物品要預(yù)先洗凈并干燥，工具等要妥為包扎，以免滅菌后取用時(shí)重新污染。包扎可用耐高溫的塑料。滅菌時(shí)應(yīng)漸進(jìn)升溫，達(dá)到預(yù)定溫度后記錄時(shí)間。烘箱內(nèi)放置的物品的數(shù)量不宜過多，以免防礙熱對流和穿透，到時(shí)間斷電后，待充分冷涼，才能打開烘箱，以免因驟冷而使器皿破裂。干熱滅菌能源消耗太大，浪費(fèi)時(shí)間。

    4、不耐熱的物質(zhì)采用過濾滅菌
    一些生長調(diào)節(jié)劑，如赤霉素、玉米素、脫落酸和某些微生物是不耐熱的，不能用高壓滅菌處理，通常采用過濾滅菌方法。
    一些化學(xué)成分在高溫高壓下回發(fā)生降解而失去效能或降低效能。經(jīng)高溫滅菌后赤霉素GA3的活性僅及不經(jīng)高溫滅菌的新鮮溶液的10%。蔗糖經(jīng)高溫后部分被降解成D-葡萄糖和D-果糖，果糖又可被部分水解，產(chǎn)生抑制培養(yǎng)的植物組織生長的物質(zhì)。高溫還可使碳水化合物和氨基酸發(fā)生反應(yīng)。IAA，NAA，2，4-D、激動(dòng)素和玉米素在高溫下是比較穩(wěn)定的。維生素具有不同程度的熱穩(wěn)定性，但如果培養(yǎng)基的PH值高于5.5，則維生素B1會(huì)被迅速降解。泛酸鈣、植物組織提取物等要過濾滅菌，不能高溫滅菌，否則會(huì)失去作用。
    防細(xì)菌濾膜的網(wǎng)孔的直徑為0.45微米以下，當(dāng)溶液通過濾液后，細(xì)菌的細(xì)胞和真菌的孢子等因大于濾膜直徑而被阻，在需要過濾滅菌的液體量大時(shí)，常使用抽濾裝置；液量小時(shí)，可用注射器。使用前對其高壓滅菌，將濾膜裝在注射器的靠針管處，將待過濾的液體裝入注射器，推壓注射器活塞桿，溶液壓出濾膜，從針管壓出的溶液就是無菌溶液。
    過濾除菌操作步驟： 首先將過濾器、接液瓶用紙包好，濾膜可放在培養(yǎng)皿內(nèi)用紙包好。使用前先經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌30分鐘；在超凈工作臺(tái)上，將濾器裝置裝好，用滅菌無齒鑷子將濾膜安放在隔板上，濾膜粗糙面向上；然后將待除菌的液體注入濾器內(nèi)，開動(dòng)真空泵即可過濾除菌。濾液經(jīng)培養(yǎng)證明無菌生長后可保存?zhèn)溆谩?/p>

    5、空間采用紫外線和熏蒸滅菌
   （1）紫外線滅菌    在接種室、超凈臺(tái)上或接種箱用紫外燈滅菌。紫外線滅菌是利用輻射因子滅菌，細(xì)菌吸收紫外線后，蛋白質(zhì)很核酸發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，引起細(xì)菌的染色體變異，造成死亡。紫外線的波長為200-300nm，其中260nm的殺菌能力zui強(qiáng)，但是由于紫外線的穿透能力很弱，所以只適于空氣和物體表面的滅菌，而且要求距照射物以不超過1.2米為宜。
   （2）熏蒸滅菌  用加熱焚燒、氧化等方法，使化學(xué)藥劑變?yōu)闅怏w狀態(tài)擴(kuò)散到空氣中，以殺死空氣和物體表面的微生物。這種方法簡便，只需要把消毒的空間關(guān)閉緊密即可。
    化學(xué)消毒劑的種類很多，它們使微生物的蛋白質(zhì)變性，或競爭其酶系統(tǒng)，或降低其表面張力，增加菌體細(xì)胞漿膜的通透性，使細(xì)胞破裂或溶解。一般說來，溫度越高，作用時(shí)間越長，殺菌效果越好。另外，由于消毒劑必須溶解于水才能發(fā)揮作用，所以要制成水溶狀態(tài)，如升汞與高錳酸鉀。還有消毒劑的濃度一般是濃度越大，殺菌能力越強(qiáng)，但石炭酸和酒精例外。
    常用熏蒸劑是甲醛，熏蒸時(shí)，房間關(guān)閉緊密，按5-8ml/m 3 用量，將甲醛置于廣口容器中，加5g/m 3 高錳酸鉀氧化揮發(fā)。熏蒸時(shí)，房間可預(yù)先噴濕以加強(qiáng)效果。冰醋酸也可進(jìn)行加熱熏蒸，但效果不如甲醛。

    6、一些物體表面用藥劑噴霧滅菌
    物體表面可用一些藥劑涂搽，噴霧滅菌。如桌面、墻面、雙手、植物材料表面等，可用75%的酒精反復(fù)涂搽滅菌，1%-2%的來蘇兒溶液以及0.25%-1%的新潔爾滅也可以。

    7、植物材料表面用消毒劑滅菌
    從外界或室內(nèi)選取的植物材料，都不同程度地帶有各種微生物。這些污染源一旦帶入培養(yǎng)基，便會(huì)造成培養(yǎng)基污染。因此，植物材料必須經(jīng)嚴(yán)格的表面滅菌處理，再經(jīng)無菌操作手續(xù)接種到培養(yǎng)基上，這一過程叫做接種。接種的植物材料叫做外植體（explant）。
    首先，將采來的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細(xì)洗干凈，如用適當(dāng)?shù)乃⒆拥人⑾?。把材料切割成適當(dāng)大小，即滅菌容器能放入為宜。置自來水下流水沖洗幾分鐘至數(shù)小時(shí)，沖洗時(shí)間視材料清潔程度而宜。易漂浮或細(xì)小的材料，可裝入紗布袋內(nèi)沖洗。流水沖洗在污染嚴(yán)重時(shí)特別有用。
    洗時(shí)可加入洗衣粉清洗，然后再用自來水沖洗洗衣粉水。洗衣粉可除去輕度附著在植物表面的污物，除去脂質(zhì)性的物質(zhì)，便于滅菌液的直接接觸。當(dāng)然，的清洗物質(zhì)是表面活性物質(zhì)吐溫。
    第二步是對材料的表面浸潤滅菌。要在超凈臺(tái)或接種箱內(nèi)完成，準(zhǔn)備好消毒的燒杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、無菌水、手表等。用70%酒精浸10-30秒。由于酒精具有使植物材料表面被浸濕的作用，加之70%酒精穿透力強(qiáng)，也很易殺傷植物細(xì)胞，所以浸潤時(shí)間不能過長。有一些特殊的材料，如果實(shí)、花蕾、包有苞片、苞葉等的孕穗，多層鱗片的休眠芽等等，以及主要取用內(nèi)部的材料，則可只用70%酒精處理稍長的時(shí)間。處理完的材料在無菌條件下，待酒精蒸發(fā)后再剝除外層，取用內(nèi)部材料。
    第三步是用滅菌劑處理。表面滅菌劑的種類較多，可根據(jù)情況選取1-2種使用見下表。

常用滅菌劑使用濃度及效果比較 表

    上述滅菌劑應(yīng)在使用前臨時(shí)配制，氯化汞可短期內(nèi)儲(chǔ)用。次氯酸鈉和次氯酸鈣都是利用分解產(chǎn)生氯氣來殺菌的，故滅菌時(shí)用廣口瓶加蓋較好；升汞是由重金屬汞離子來達(dá)到滅菌的；過氧化氫是分解中釋放原子態(tài)氧來殺菌的，這種藥劑殘留的影響較小，滅菌后用無菌水漂洗3-4次即可；由于升汞液滅菌的材料，難以對升汞殘毒去除，所以應(yīng)當(dāng)用無菌水漂洗8-10次，每次不少于3分鐘，以盡量去除殘毒。
    滅菌時(shí)，不瀝干的植物材料轉(zhuǎn)放到燒杯或其他器皿中，記好時(shí)間，倒入消毒溶液，不時(shí)用玻璃棒輕輕攪動(dòng)，以促進(jìn)材料各部分與消毒溶液充分接觸，驅(qū)除氣泡，使消毒*。在快到時(shí)間之前1-2分鐘，開始把消毒液傾入一備好的大燒杯內(nèi)，要注意勿使材料倒出，氫凈后立即倒入無菌水，輕攪漂洗。滅菌時(shí)間是從倒入消毒液開始，至倒入無菌水時(shí)為止。記錄時(shí)間還便于比較消毒效果，以便改正。滅菌液要充分浸沒材料。寧可多用些滅菌液，切勿勉強(qiáng)在一個(gè)體積偏小的容器中使用很多材料滅菌。
    在滅菌溶液中加吐溫-80或Triton X效果較好，這些表面活性劑主要作用是使藥劑更易于展布，更容易浸入到滅菌的材料表面。但吐溫加入后對材料的傷害也在增加，應(yīng)注意吐溫的用量和滅菌時(shí)間，一般加入滅菌液的0.5%，即在100ml加入15滴。
    zui后一步是用無菌水漂洗，漂洗要求3分鐘左右，視采用的消毒液種類，漂洗3-10次左右。無菌水漂洗作用是免除消毒劑殺傷植物細(xì)胞的副作用。

滅菌原理

     紫外線滅菌的原理: 紫外線滅菌是用紫外線管照射進(jìn)行的。波長在 220-300納米的紫外線稱為“殺生命區(qū)”，其中以260鈉米的殺菌力zui強(qiáng)。紫外線作用于細(xì)胞DNA，使DNA鏈上相鄰的嘧啶堿形成嘧啶二聚體（如胸腺嘧啶二聚體），抑制了DNA復(fù)制。另外，空氣在紫外線照射下可以產(chǎn)生臭氧，臭氧也有一定的殺菌作用。紫外線透過物質(zhì)的能力很差，適用于空氣及物體表面的滅菌，與被照物的距離以不超過1.2米為易，照射時(shí)間以視紫外線燈管的功率大小、被照空間及面積大小，根據(jù)滅菌效果測定結(jié)果而定。由于紫外線對人體有傷害作用，因此，不要在紫外線燈照射下進(jìn)行操作。

     氯化汞滅菌的原理： 氯化汞也稱升汞，是一種劇毒的重金屬鹽殺菌劑，其殺菌的原理是 Hg2+可與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合，使細(xì)菌蛋白變性，酶失活。氯化汞使用濃度0.1%-0.2%，浸泡6-12分鐘時(shí)，就可以有效地殺死附著在外植體表面的細(xì)菌及真菌芽孢，滅菌效果*。

但用氯化汞滅過菌的外植體材料要用無菌水反復(fù)多次洗滌（一般不少于 5次），才可將殘留的藥劑除凈。使用氯化汞給環(huán)境造成污染，一般情況下，應(yīng)盡量用其它消毒劑滅菌，而以少用或不用氯化汞為易。

     次氯酸鈉滅菌的原理： 次氯酸鈉又稱為 “安替福民”，活性氧含量是0.8%,使用時(shí)稀釋3-5倍,浸泡外植體5-30分鐘,再用無菌水洗滌4-5次.它分解出具有殺菌作用的氯氣,滅菌后易于除去,不留殘余,殺菌力強(qiáng),對植物材料無害,是植物組織培養(yǎng)常使用的殺菌劑之一。

     漂白粉滅菌的原理： 漂白粉為白色粉末，一般含 10%-20%（質(zhì)量/體積）的次氯酸鈣[Ca（ClO）2],使用時(shí)用飽和溶液，殺菌的原理在于它分解出具有殺菌作用的氯氣。氯與蛋白質(zhì)中的氨基結(jié)合，使菌體蛋白質(zhì)氧化，代謝功能發(fā)生障礙。注意漂白粉腐蝕金屬、棉織品，刺激皮膚，易吸潮散失有效氯而失效，平時(shí)要密封儲(chǔ)藏，現(xiàn)配現(xiàn)用，不要儲(chǔ)藏太久。

     酒精滅菌的原理： 酒精具有較強(qiáng)的穿透力和殺菌力，它使細(xì)菌蛋白質(zhì)變性。使用的濃度一般為 70%-75%。處理時(shí)間15-30秒，不宜太長，因?yàn)榧?xì)胞容易收縮脫水。它具有浸潤和滅菌的雙重作用，適用于表面消毒，但不能達(dá)到*的滅菌，必須結(jié)合其它藥劑滅菌。
     為了提高乙醇的殺菌效果，可在乙醇溶液中加入0.1%的酸或堿,以改變細(xì)胞表面帶電荷的性質(zhì)而增加膜透性,提高乙醇的殺菌效果。

     高錳酸鉀滅菌的原理： 高錳酸鉀能使細(xì)菌酶蛋白中的基氧化成二硫基而失去酶活性。濃度稀釋時(shí)起氧化作用殺死細(xì)菌，日常生活中通常用作皮膚、果蔬的表面消毒劑，在一盆清水中加幾粒高錳酸鉀就可起到殺菌的作用。

接    種

     接種時(shí)由于有一個(gè)敞口的過程，所以是極易引起污染的時(shí)期，這一時(shí)期主要由空氣中的細(xì)菌和工作人員本身引起，接種室要嚴(yán)格進(jìn)行空間消毒。接種室內(nèi)保持定期用1%-3%的高錳酸鉀溶液對設(shè)備、墻壁、地板等進(jìn)行搽洗。除了使用前用紫外線和甲醛滅菌外，還可在使用期間用70%的酒精或3%的來蘇兒噴霧，使空氣中灰塵顆粒沉降下來。無菌操作可按以下步驟進(jìn)行：
    （1）在接種4小時(shí)前用甲醛熏蒸接種室，并打開其內(nèi)紫外線燈進(jìn)行殺菌；
    （2）在接種前20分鐘，打開超凈工作臺(tái)的風(fēng)機(jī)以及臺(tái)上的紫外線燈；
    （3）接種員先洗凈雙手，在緩沖間換好實(shí)驗(yàn)服，并換穿拖鞋等；
    （4）上工作臺(tái)后，用酒精棉球搽拭雙手，特別是指甲處。然后搽拭工作臺(tái)面；
    （5）先用酒精棉球搽拭接種工具，再將鑷子和剪刀從頭至尾過火一遍，然后反復(fù)過火處，對培養(yǎng)皿要過火烤干；
    （6）接種時(shí)，接種員雙手不能離開工作臺(tái)，不能說話、走動(dòng)和咳嗽等；
    （7）接種完畢后要清理干凈工作臺(tái)，可用紫外線燈滅菌30分鐘，若連續(xù)接種，每5天要大強(qiáng)度滅菌一次。

    接種是將已消毒好的根、莖、葉等離體器官，經(jīng)切割或剪裁成小段或小塊，放入培養(yǎng)基的過程?，F(xiàn)將接種前后的程序連貫地介紹。

無菌接種步驟：

（ 1 ）將初步洗滌及切割的材料放入燒杯，帶入超凈臺(tái)上，用消毒劑滅菌，再用無菌水沖洗，zui后瀝去水分，取出放置在滅過菌的紗布上或?yàn)V紙上。
     （ 2 ）材料吸干后，一手拿鑷子、一手拿剪刀或解剖刀，對材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)那懈?。如葉片切成 0.5cm 平方的小塊；莖切成含有一個(gè)節(jié)的小段。微莖尖要?jiǎng)兂芍缓?1-2 片幼葉的莖尖大小等。在接種過程中要經(jīng)常灼燒接種器械，防止交叉污染。
     （ 3 ）用灼燒消毒過的器械將切割好的外植體插植或放置到培養(yǎng)基上。具體操作過程（以試管為例）是：先解開包口紙，將試管幾乎水平拿著，使試管口靠近酒精燈火焰，并將管口在火焰上方轉(zhuǎn)動(dòng)，使管口里外灼燒數(shù)秒鐘。若用棉塞蓋口，可先在管口外面灼燒，去掉棉塞，再燒管口里面。然后用鑷子夾取一塊切好的外植體送入試管內(nèi)，輕輕插入培養(yǎng)基上。若是葉片直接附在培養(yǎng)基上，以放 1-3 塊為宜。至于材料放置方法除莖尖、莖段要正放（向上）外，其他尚無統(tǒng)一要求。接種完后，將管口在火焰上再灼燒數(shù)秒種。并用棉塞，塞好后，包上包口紙，包口紙里面也要過火。

培   養(yǎng)

    培養(yǎng)指把培養(yǎng)材料放在培養(yǎng)室（有光照、溫度條件）里，使之生長，分裂和分化形成愈傷組織或進(jìn)一步分化成再生植株的過程。
       1、培養(yǎng)方法
   （1）固體培養(yǎng)法
    即用瓊脂固化培養(yǎng)基來培養(yǎng)植物材料的方法。是現(xiàn)在zui常用的方法。雖然該方法設(shè)備簡單，易行，但養(yǎng)分分布不均，生長速度不均衡，并常有褐化中毒現(xiàn)象發(fā)生。
   （2）液體培養(yǎng)法
    即用不加固化劑的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)植物材料的方法。由于液體中氧氣含量較少，所以通常需要通過攪動(dòng)或振動(dòng)培養(yǎng)液的方法以確保氧氣的供給，采用往復(fù)式搖床或旋轉(zhuǎn)式搖床進(jìn)行培養(yǎng)，其速度一般為50-100r/min，這種定期浸沒的方法，既能使培養(yǎng)基均一，又能保證氧氣的供給。
    2、培養(yǎng)步驟
   （1）初代培養(yǎng)
    初代培養(yǎng)旨在獲得無菌材料和無性繁殖系。即接種某些外植體后，zui初的幾代培養(yǎng)。初代培養(yǎng)時(shí)，常用誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基中含有較多的細(xì)胞分裂素和少量的生長素。初代培養(yǎng)建立的無性繁殖系包括：莖梢、芽叢、胚狀體和原球莖等。根據(jù)初代培養(yǎng)時(shí)發(fā)育的方向可分為：
    1）頂芽和腋芽的發(fā)育
    采用外源的細(xì)胞分裂素，可促進(jìn)使具有頂芽或沒有腋芽的休眠側(cè)芽啟動(dòng)生長，從而形成一個(gè)微型的多枝多芽的小灌木叢狀的結(jié)構(gòu)。在幾個(gè)月內(nèi)可以將這種叢生苗的一個(gè)枝條轉(zhuǎn)接繼代，重復(fù)芽苗增殖的培養(yǎng)，并且迅速獲得多數(shù)的嫩莖。然后將一部分嫩莖轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上，就能得到可種植到土壤中去的完整小植株。一些木本植物和少數(shù)草本植物也可以通過這種方式來進(jìn)行再生繁殖，如月季、茶花、菊花、香石竹等等。這種繁殖方式也稱作微型繁殖，它不經(jīng)過發(fā)生愈傷組織而再生，所以是zui能使無性系后代保持原品種的一種繁殖方式。
     適宜這種再生繁殖的植物，在采樣時(shí)，只能采用頂芽、側(cè)芽或帶有芽的莖切段，其他如種子萌發(fā)后取枝條也可以。
     莖尖培養(yǎng)可看作是這方面較為特殊的一種方式。它采用極其幼嫩的頂芽的莖尖分生組織作為外植體進(jìn)行接種。在實(shí)際操作中，采用包括莖尖分生組織在內(nèi)的一些組織來培養(yǎng)，這樣便保證了操作方便以及容易成活。
     用靠培養(yǎng)定芽得到的培養(yǎng)物一般是莖節(jié)較長，有直立向上的莖梢，擴(kuò)繁時(shí)主要用切割莖段法，如香石竹、矮牽牛、菊花等。但特殊情況下也會(huì)生出不定芽，形成芽叢。
     2）不定芽的發(fā)育
     在培養(yǎng)中由外植體產(chǎn)生不定芽，通常首先要經(jīng)脫分化過程，形成愈傷組織的細(xì)胞。然后，經(jīng)再分化，即由這些分生組織形成器官原基，它在構(gòu)成器官的縱軸上表現(xiàn)出單向的極性（這與胚狀體不同）。多數(shù)情況下它形成芽，后形成根。
     另一種方式是從器官中直接產(chǎn)生不定芽，有些植物具有從各個(gè)器官上長出不定芽的能力如矮牽牛、福祿考、懸鉤子等。當(dāng)在試管培養(yǎng)的條件下，培養(yǎng)基中提供了營養(yǎng)，特別是提供了連續(xù)不斷植物激素的供應(yīng)，使植物形成不定芽的能力被大大地激發(fā)起來。許多種類的外植體表面幾乎全部為不定芽所覆蓋。在許多常規(guī)方法中不能無性繁殖的種類，在試管條件下卻能較容易地產(chǎn)生不定芽而再生，如柏科，松科，銀杏等一些植物。許多單子葉植物儲(chǔ)藏器官能強(qiáng)烈地發(fā)生不定芽，用百合鱗片的切塊就可大量形成不定鱗莖。
     在不定芽培養(yǎng)時(shí)，也常用誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基。用靠培養(yǎng)不定芽得到的培養(yǎng)物，一般采用芽叢進(jìn)行繁殖，如非洲菊、草莓等。
     3）體細(xì)胞胚狀體的發(fā)生與發(fā)育
     體細(xì)胞胚狀體類似于合子胚但又有所不同，它也通過球形，心形，魚雷形和子葉形的胚胎發(fā)育時(shí)期，zui終發(fā)育成小苗。但它是由體細(xì)胞發(fā)生的。胚狀體可以從愈傷組織表面產(chǎn)生，也可從外植體表面已分化的細(xì)胞中產(chǎn)生，或從懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞中產(chǎn)生。
     4）初代培養(yǎng)外植體的褐變
     外植體褐變是指在接種后，其表面開始褐變，有時(shí)甚至?xí)拐麄€(gè)培養(yǎng)基褐變的現(xiàn)象。它的出現(xiàn)是由于植物組織中的多酚氧化酶被激活，而使細(xì)胞的代謝發(fā)生變化所致。在褐變過程中，會(huì)產(chǎn)生醌類物質(zhì)，它們多呈棕褐色，當(dāng)擴(kuò)散到培養(yǎng)基后，就會(huì)抑制其他酶的活性，從而影響所接觸外植體的培養(yǎng)。
    褐變的主要原因如下：
    a、植物品種    研究表明，在不同品種間的褐變現(xiàn)象是不同的。由于多酚氧化酶活性上的差異，因此，有些花卉品種的外植體在接種后較容易褐變，而有些花卉品種的外植體在接種后不容易褐變。因此，在培養(yǎng)過程中應(yīng)該有所選擇，對不同的品種分別進(jìn)行處理。
    b、生理狀態(tài)    由于外植體的生理狀態(tài)不同，所以在接種后褐變程度也有所不同。一般說來，處于幼齡期的植物材料褐變程度較淺，而從已經(jīng)成年的植株采收的外植體，由于含醌類物質(zhì)較多，因此褐變較為嚴(yán)重。一般來說，幼嫩的組織在接種后褐變程度并不明顯，而老熟的組織在接種后褐變程度較為嚴(yán)重。
    c、培養(yǎng)基成分    濃度過高的無機(jī)鹽會(huì)使某些觀賞植物的褐變程度增加，此外，細(xì)胞分裂素的水平過高也會(huì)刺激某些外植體的多酚氧化酶的活性，從而使褐變現(xiàn)象加深。
    d、培養(yǎng)條件不當(dāng)  如果光照過強(qiáng)、溫度過高、培養(yǎng)時(shí)間過長等，均可使多酚氧化酶的活性提高，從而加速被培養(yǎng)的外植體的褐變程度。
    為了提高組織培養(yǎng)的成苗率，必須對外植體的褐變現(xiàn)象加以控制。可以采用以下措施防止、減輕褐變現(xiàn)象的發(fā)生。
    1、選擇合適的外植體   一般來說，選擇生長處于旺盛的外植體，這樣可以使褐變現(xiàn)象明顯減輕。
    2、合適的培養(yǎng)條件    無機(jī)鹽成分、植物生長物質(zhì)水平、適宜溫度、及時(shí)繼代培養(yǎng)均可以減輕材料的褐變現(xiàn)象。
    3、使用抗氧化劑    在培養(yǎng)基中，使用半胱氨酸、抗壞血酸等抗氧化劑能夠較為有效地避免或減輕很多外植體的褐變現(xiàn)象。另外，使用0.1%-0.5%的活性炭對防止褐變也有較為明顯的效果。
    4、連續(xù)轉(zhuǎn)移    對容易褐變的材料可間隔2-24小時(shí)的培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，這樣經(jīng)過連續(xù)處理7-10天后，褐變現(xiàn)象便會(huì)得到控制或大為減輕。

    （2）繼代培養(yǎng)
    在初代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上所獲得的芽、苗、胚狀體和原球莖等，數(shù)量都還不夠，它們需要進(jìn)一步增殖，使之越來越多，從而發(fā)揮快速繁殖的優(yōu)勢。
    繼代培養(yǎng)是繼初代培養(yǎng)之后的連續(xù)數(shù)代的擴(kuò)繁殖培養(yǎng)過程。旨在繁殖出相當(dāng)數(shù)量的無根苗，zui后能達(dá)到邊繁殖邊生根的目的。繼代培養(yǎng)的后代是按幾何級數(shù)增加的過程。如果以2株苗為基礎(chǔ)，那么經(jīng)10代將生成2 10 株苗。
    繼代培養(yǎng)中擴(kuò)繁的方法包括：切割莖段、分離芽叢、分離胚狀體、分離原球莖等。切割莖段常用于有伸長的莖梢、莖節(jié)較明顯的培養(yǎng)物。這種方法簡便易行，能保持母種特性。培養(yǎng)基常是MS基本培養(yǎng)基；分離芽叢適于由愈傷組織生出的芽叢。培養(yǎng)基常是分化培養(yǎng)基。若芽叢的芽較小?？上惹谐裳繀残K，放入MS培養(yǎng)基中，待到稍大時(shí)，再分離開來繼續(xù)培養(yǎng)。
    增殖使用的培養(yǎng)基對于一種植物來說每次幾乎*相同，由于培養(yǎng)物在接近zui良好的環(huán)境條件，營養(yǎng)供應(yīng)和激素調(diào)控下，排除了其他生物的競爭，所以能夠按幾何級數(shù)增殖。
    在快速繁殖中初代培養(yǎng)只是一個(gè)必經(jīng)的過程，而繼代培養(yǎng)則是經(jīng)常性不停的進(jìn)行過程。但在達(dá)到相當(dāng)數(shù)量之后，則應(yīng)考慮使其中一部分轉(zhuǎn)入生根階段。從某種意義上講，增殖只是儲(chǔ)備母株，而生根才是增殖材料的分流，生產(chǎn)出成品。
   （3）繼代培養(yǎng)時(shí)材料的玻璃化
    實(shí)踐表明，當(dāng)植物材料不斷地進(jìn)行離體繁殖時(shí)，有些培養(yǎng)物的嫩莖、葉片往往會(huì)呈半透明水跡狀，這種想象通常稱為玻璃化。它的出現(xiàn)會(huì)使試管苗生長緩慢、繁殖系數(shù)有所下降。玻璃化為試管苗的生理失調(diào)癥。
    因?yàn)槌霈F(xiàn)玻璃化的嫩莖不宜誘導(dǎo)生根，因此，使繁殖系數(shù)大為降低。在不同的種類、品種間，試管苗的玻璃化程度也有所差異。當(dāng)培養(yǎng)基上細(xì)胞分裂素水平較高時(shí)，也容易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。在培養(yǎng)基中添加少量聚乙烯醇、脫落酸等物質(zhì)，能夠在一定程度上減輕玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生。
    呈現(xiàn)玻璃化的試管苗，其莖、葉表面無蠟質(zhì)，體內(nèi)的極性化合物水平較高，細(xì)胞持水力差，植株蒸騰作用強(qiáng)，無法進(jìn)行正常移栽。這種情況主要是由于培養(yǎng)容器中空氣濕度過高，透氣性較差造成的，其具體解決的方法為：
    a、增加培養(yǎng)基中的 溶質(zhì)水平，以降低培養(yǎng)基的水勢；
    b、減少培養(yǎng)基中含氮化合物的用量；
    c、增加光照
    d、增加容器通風(fēng)，進(jìn)行CO2施肥，這對減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象有明顯的作用；
    e、降低培養(yǎng)溫度，進(jìn)行變溫培養(yǎng)，有助于減輕試管苗玻璃化現(xiàn)象發(fā)生；
    f、降低培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素含量，可以考慮加入適量脫落酸。

3、生根培養(yǎng)
   當(dāng)材料增殖到一定數(shù)量后，就要使部分培養(yǎng)物分流到生根培養(yǎng)階段。若不能及時(shí)將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上去，就會(huì)使久不轉(zhuǎn)移的苗子發(fā)黃老化，或因過分擁擠而使無效苗增多造成拋棄浪費(fèi)。根培養(yǎng)是使無根苗生根的過程，這個(gè)過程目的是使生出的不定根濃密而粗壯。生根培養(yǎng)可采用1/2或者1/4MS培養(yǎng)基，全部去掉細(xì)胞分裂素，并加入食糧非的生長素（NAA、IBA等）。
     誘導(dǎo)生根可以采用下列方法
    a、將新梢基部浸入50或100*10-6IBA溶液中處理4-8小時(shí)；
    b、在含有生長素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-6天
    c、直接移入含有生長素的生根培養(yǎng)基中。
    上述三種方法均能誘導(dǎo)新梢生根，但前兩種方法對新生根的生長發(fā)育則更為有利。而第三種對幼根的生長有抑制作用。其原因是當(dāng)根原始體形成后較高濃度生長素的繼續(xù)存在，則不利于幼根的生長發(fā)育。不過這種方法比較可行。
     另外也可采用下列方法就可生根。1、延長在增殖培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時(shí)間；2、有意降低一些增殖倍率，減少細(xì)胞分裂素的用量（即將增殖與生根合并為一步）；3、切割粗壯的嫩枝在營養(yǎng)缽中直接生根，此方法則沒有生根階段?？梢允∪ヒ淮闻囵B(yǎng)基制作，切割下的插穗可用生長素溶液浸蘸處理，但這種方法只適于一些容易生根的作物。
     另外少數(shù)植物生根比較困難時(shí)，則需要在培養(yǎng)基中放置濾紙橋，使其略高于液面，靠濾紙的吸水性供應(yīng)水和營養(yǎng)，從而誘發(fā)生根。
     從胚狀體發(fā)育成的小苗，常常有原先已分化的根，這種根可以不經(jīng)誘導(dǎo)生根階段而生長。但因經(jīng)胚狀體發(fā)育的苗數(shù)特別多，并且個(gè)體較小，所以也常需要一個(gè)低濃度或沒有植物激素的培養(yǎng)基培養(yǎng)的階段，以便壯苗生根。
     試管內(nèi)生根壯苗的階段，為了成功地將移植到試管外的環(huán)境中，以使試管苗適應(yīng)外界的環(huán)境條件。通常不同植物的適宜馴化溫度不同。如菊花，以18-20℃為宜。實(shí)踐證明植物生長的溫度過高不但會(huì)牽涉到蒸騰加強(qiáng)。而且還牽涉到菌類易滋生的問題。溫度過低使幼苗生長遲緩，或不易成活。春季低溫時(shí)苗床可加設(shè)電，使基質(zhì)溫度略高于氣溫2-3℃，這不但有利于生根和促進(jìn)根系發(fā)達(dá)，而且有利于提前成活。
    移植到試管外的植物苗光強(qiáng)度應(yīng)比移植前培養(yǎng)有所提高，并可適應(yīng)強(qiáng)度較高的漫射光，（約4000lx左右），以維持光合作用所需光照強(qiáng)度。但光線過強(qiáng)刺激蒸騰加強(qiáng)，會(huì)使水分平衡的矛盾更尖銳。