標準曲線法也稱為外標法或直接比較法，是一種簡便、快速的定量方法，在ELISA實驗中比較常用的一種分析方法。標準曲線做的好與壞會直接影響到實驗的結(jié)果，甚至是關(guān)系到實驗的成敗。那么在ELISA實驗中，這一方面該如何處理呢？
一、ELISA實驗標準曲線的技術(shù)解答內(nèi)容：
1.設(shè)置標準曲線樣品的標準濃度范圍要有一個比較大的跨度，并且要能涵蓋你所要檢測實驗樣品的濃度，即樣品的濃度要在標準曲線濃度范圍之內(nèi)，包括上限和下限。而對于呈S型的標準曲線，盡量要使實驗樣品的濃度在中間坡度*陡段，即曲線幾乎成直線的范圍內(nèi)。
2.采用倍比稀釋法配制標準曲線中的標準樣品濃度，這樣就能夠保證標準樣品的濃度不會出現(xiàn)較大的偏離。
3.樣品的濃度等指標是根據(jù)標準曲線計算出來的，所以首先要把做標準曲線看作是比做正式實驗還要重要的一件事，否則后面的實驗結(jié)果無從談起。
4.做出的標準曲線相關(guān)系數(shù)因?qū)嶒炓蟛煌兴儎?，但一般來說，相關(guān)系數(shù)R至少要大于0.98，對于有些實驗，至少要0.99甚至是0.999。
6.檢測標準樣品時，應(yīng)按濃度遞增順序進行，以減少高濃度對低濃度的影響，提高準確性。
7.標準曲線的樣品數(shù)一般為7個點，但至少要保證有5個點。
標準曲線濃度得到后，可通過計算器、Excell或SPSS統(tǒng)計軟件進行繪制，并得到相關(guān)的回歸方程(即計算公式)和相關(guān)系數(shù)(回歸系數(shù))。
二、選擇什么方程去擬合
用于免疫檢測的所謂“標準曲線"其實稱為擬合曲線比較合適。免疫檢測時標準點(可以是倍比稀釋的，也可以不是)濃度如果和相應(yīng)的吸光度(OD)值如果能 夠呈現(xiàn)直線關(guān)系當然是理想的了，這時可以通過EXELL等方便的獲得擬合曲線，進而推算出樣品的濃度值。但我們做免疫檢測很少有時候能夠有這么理想的情 況，標品濃度和相應(yīng)OD值往往是"S"型的曲線關(guān)系，這時就不能用直線擬合的方式了，而對擬合方法進行選擇就是必要的了。
關(guān)于標準曲線的擬合方式，直線、二次曲線、三次曲線、指數(shù)、對數(shù)等雖都可用于ELISA及其它生物學(xué)反應(yīng)中的曲線擬合，但都只適用于曲線的一部分，有的 適用于前半段，有的適用于后半段，有的適用于中間一段，而Logistic曲線則對曲線的全部都有較好的適用性。當然，如果用于定量，還是在中間一段較 好。這些方法雖然沒有一種方法可以通用，但也都可以用。關(guān)鍵在于你的標準曲線做到了S形的哪一部分，你想檢測的樣品濃度在曲線的哪一部分。在S曲線的低濃 度部分可以用乘冪方程很好的擬合，中低濃度部分可以用直線方程，中間部分可用對數(shù)方程，而中后段可用四參數(shù)。
目前國際上流行的免疫檢測擬合方式是“四參數(shù)邏輯擬合"，用這種擬合方式往往能夠比較精確的反映濃度和吸光度的曲線關(guān)系，從而進一步比較正確的獲得樣品中待測物質(zhì)的濃度值。
其實，在一個長的區(qū)間內(nèi)，Logistic應(yīng)該都能擬合得較為理想。但并不是說它就是萬能的。事實上不僅是ELISA，其它很多生物學(xué)反應(yīng)都是S形曲 線，也都可以用Logistic曲線擬合。但建模型是一回事，而用它來定量是另一回事。如果用來定量，S形曲線的中間段(較陡處)是比較好的，而兩端的平 坦部分計算誤差會大，有時甚至?xí)艽蟆?br />
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