PCR反應擴增產(chǎn)物出現(xiàn)多條帶(雜帶)解決方案

來源：上海撫生實業(yè)有限公司 2024年07月08日 15:41

　　聚合酶鏈反應(PCR)技術(shù)是在體外進行的由引物介導的酶促DNA擴增反應。PCR的原理是在模板DNA、PCR引物、四種脫氧核糖核苷酸(dNTP)及適當濃度的Mg2+存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的體外酶促合成反應。兩個引物分別位于靶序列兩端，同兩條模板的3’端互補，由此限定擴增片段。PCR反應由一系列的變性→退火→延伸反復循環(huán)構(gòu)成，即在高溫下模板雙鏈DNA變性解鏈，然后在較低溫度下同過量引物退火，再在適中溫度下由DNA聚合酶催化進行延伸。理論上，經(jīng)過N次循環(huán)可使特定片段擴增到2n-1，考慮到擴增效率達不到100%，所以通常經(jīng)25到30次循環(huán)可擴增到106倍，足夠后續(xù)實驗展開。

　　擴增產(chǎn)物出現(xiàn)多條帶(雜帶)：

　　1、引物用量偏大，引物的特異性不高。應調(diào)換引物或降低引物的使用量。

　　2、循環(huán)的次數(shù)過多。適當增加模板的量，減少循環(huán)次數(shù)。

　　3、酶的用量偏高或酶的質(zhì)量不好，應降低酶量或調(diào)換另一來源的酶。

　　4、退火溫度偏低，退火及延伸時間偏長。應提高退火溫度，減少變性與延伸時間，也可采用二種溫度的PCR擴增。以2度為梯度設(shè)計梯度PCR反應優(yōu)化退火溫度。

　　5、樣品處理不當。

　　6、 Mg2+濃度偏高，因適當調(diào)整Mg2+使用濃度。

　　7、若為PCR試劑盒，也可能時試劑盒本身質(zhì)量有問題。

　　8、復制提前終止。使用非熱啟動的聚合酶時常有發(fā)生。冰上準備反應體系或采用熱啟動聚合酶。

　　9、反應緩沖液未全融化或未充分混勻。確保反應緩沖液融化全并全混勻。

　　10、引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計引物。

　　11、引物量過多。減少反應體系中引物的用量。

　　12、模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應<50ng，而基因組DNA則應<200ng。

　　13、外源DNA污染。確保操作的潔凈。

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