摘　要:本文對(duì)近年來(lái)化學(xué)發(fā)光聯(lián)用技術(shù)在獸藥殘留分析中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行了評(píng)述,主要包括化學(xué)發(fā)光免疫分析、分子印跡2化學(xué)發(fā)光分析、微流控芯片2化學(xué)發(fā)光檢測(cè)等,引用文獻(xiàn)31篇。
關(guān)鍵詞:化學(xué)發(fā)光分析;獸藥殘留分析;聯(lián)用技術(shù);評(píng)述

1 　引言
    獸藥對(duì)改善動(dòng)物的生存條件、降低動(dòng)物的發(fā)病率和死亡率及促進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)增產(chǎn)等具有極其重要的作用,是當(dāng)前養(yǎng)殖業(yè)*的物質(zhì)基礎(chǔ)。但由于科學(xué)用藥知識(shí)的缺乏和經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使,濫用獸藥和非法使用禁用獸藥,致使少量的藥物原體、有毒代謝物、降解物及雜質(zhì)等殘留在動(dòng)物的肉和各種組織中,即獸藥殘留（Animal Drug Residues） ,它已嚴(yán)重威脅著人們的身體健康和生命安全。進(jìn)食不安全已成為*關(guān)注的焦點(diǎn)問(wèn)題之一,如雌激素、喹惡啉類、硝基呋喃類、硝基咪唑類等獸藥殘留都已證明有“三致”作用。因此,世界各國(guó)都高度重視食品安全,采取各種措施限制乃至禁止某些獸藥的使用,并采用的技術(shù)和方法加強(qiáng)動(dòng)物性食品中的獸藥殘留檢測(cè)。
    我國(guó)作為動(dòng)物性食品的生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó),如何提高產(chǎn)品的品質(zhì),減少藥物殘留,已成為養(yǎng)殖業(yè)乃至整個(gè)農(nóng)業(yè)發(fā)展亟待解決的問(wèn)題。因此,研究獸藥殘留的高靈敏的檢測(cè)方法,既是保證動(dòng)物性食品的安全,也是我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)適應(yīng)市場(chǎng)化的要求、避免貿(mào)易爭(zhēng)端所必需采取的措施。近年來(lái)化學(xué)發(fā)光聯(lián)用技術(shù)在獸藥殘留分析領(lǐng)域中的應(yīng)用十分引人注目。本文就其應(yīng)用進(jìn)展作一簡(jiǎn)要綜述。

2 　化學(xué)發(fā)光分析法的特點(diǎn)
    化學(xué)發(fā)光分析法（Chemiluminescence , CL） 是借助于化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象,基于化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度和被測(cè)物含量之間的關(guān)系建立起來(lái)的一種分析方法,它無(wú)需光源和色散裝置等復(fù)雜設(shè)備,因而避免了光源不穩(wěn)定性和光學(xué)分析中常見(jiàn)的散射光、雜散光等的干擾,檢測(cè)背景低,具有靈敏度高（10 - 10 ～10 - 21 mol/ L） 、線性范圍寬（3～6 數(shù)量級(jí)） 、設(shè)備簡(jiǎn)單、分析快速等優(yōu)點(diǎn);化學(xué)發(fā)光分析還具有所謂的“化學(xué)譜帶變窄”效應(yīng),它是由化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)速度很快引起的,即樣品還未充分?jǐn)U散到本體溶液前就已產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào),因此很適合于在線快速檢測(cè),且記錄的信號(hào)峰尖銳,不會(huì)造成明顯的區(qū)帶展寬。
    化學(xué)發(fā)光分析測(cè)定的物質(zhì)可以分為三類:*類物質(zhì)是化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中的反應(yīng)物;第二類物質(zhì)是化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中的催化劑、增敏劑或抑制劑;第三類物質(zhì)是偶合反應(yīng)中的反應(yīng)物、催化劑、增敏劑等。而這三類物質(zhì)還可以通過(guò)標(biāo)記等方式用來(lái)測(cè)定人們感興趣的其它物質(zhì)。化學(xué)發(fā)光分析測(cè)定物質(zhì)的方式可分為直接法和間接法,并通過(guò)與其它分析技術(shù)聯(lián)用,進(jìn)一步擴(kuò)大了應(yīng)用范圍。
    廣義的化學(xué)發(fā)光包括電致化學(xué)發(fā)光（ Elet rogenerated Chemiluminescence , ECL） ,它是指在電極表面附近發(fā)生電極反應(yīng)或電極反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)一步發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象,集化學(xué)發(fā)光分析法和電化學(xué)分析法的優(yōu)點(diǎn)于一體,因此,近年來(lái)受到廣泛的關(guān)注。
    化學(xué)發(fā)光分析用于獸藥殘留檢測(cè)的方式通常有兩種:一是根據(jù)化學(xué)發(fā)光反應(yīng),或采用直接法（直接檢測(cè)殘留物） ,或采用間接法（殘留物增強(qiáng)或抑制化學(xué)發(fā)光反應(yīng)、殘留物與發(fā)光反應(yīng)偶合、酶聯(lián)免疫化學(xué)發(fā)光法等） 檢測(cè)獸藥殘留。常用的發(fā)光試劑有魯米諾類（Luminol ） 、聯(lián)吡啶釕（ Ⅱ） 配合物（ Ru （ bipy） 2 +3 、Ru （p hen） 2 +3 ） 、過(guò)氧草酸鹽類（ Peroxalate） 、吖啶衍生物（Acirdinium） 、二氧環(huán)乙烷類和洛粉堿類等,其中以魯米諾類和聯(lián)吡啶釕類化學(xué)發(fā)光體系應(yīng)用;二是化學(xué)發(fā)光作為檢測(cè)器與其它技術(shù)聯(lián)用,如化學(xué)發(fā)光還可與液相色譜（ HPLC） 聯(lián)用,或者與固相萃取結(jié)合,實(shí)現(xiàn)殘留物的在線檢測(cè)。
化學(xué)發(fā)光作為獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)有三大優(yōu)勢(shì):一是化學(xué)發(fā)光分析方法本身的超高靈敏度,零背景干擾;二是殘留的獸藥小分子（包括殘留標(biāo)志物） 通常是含有- C = C - 、- C = O、- N = N - 、- N = O、- P = O 等官能團(tuán)及苯環(huán)或多元雜環(huán)的化合物,易于成為化學(xué)發(fā)光分析檢測(cè)的對(duì)象;三是發(fā)光試劑可通過(guò)電化學(xué)的方法循環(huán)使用（電化學(xué)發(fā)光） ,如釕（ Ⅱ） 聯(lián)吡啶（Ru （ bipy） 2 +3 ） 體系。屈穎娟等基于鹽酸克倫特羅（Clenbuterol ,CLB） ,俗稱“瘦肉精”對(duì)Ru （bipy） 2 +3 電化學(xué)發(fā)光信號(hào)有較強(qiáng)的增敏作用,建立了一種高靈敏測(cè)定鹽酸克倫特羅的電化學(xué)發(fā)光分析法,他們還將此電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器和紫外檢測(cè)器兩者的檢出限作了對(duì)比,結(jié)果表明前者的檢出限比后者降低了2 個(gè)數(shù)量級(jí)。
    另外,化學(xué)發(fā)光由于不需要光源,其檢測(cè)系統(tǒng)比激光誘導(dǎo)熒光更易微型化、集成化,非常適合作為微流控芯片的檢測(cè)器。

3 　化學(xué)發(fā)光分析法在獸藥殘留分析中的應(yīng)用
3. 1 　化學(xué)發(fā)光免疫分析法
    化學(xué)發(fā)光免疫分析法（Chemiluminscent Immunoassay ,CL IA） 是根據(jù)放射免疫分析（RIA） 的基本原理,將高度靈敏的化學(xué)發(fā)光與高度特異的免疫分析法相結(jié)合建立起來(lái)的一種非放射性檢測(cè)手段。它是將發(fā)光物質(zhì)或酶標(biāo)記在抗原或抗體上,免疫反應(yīng)結(jié)束后,加入氧化劑或酶底物而發(fā)光,通過(guò)測(cè)量發(fā)光強(qiáng)度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定待測(cè)物的濃度。CL IA 主要的優(yōu)點(diǎn)是:
    （1） 高靈敏度,由于不需要外來(lái)光源,具有比熒光法更高的信噪比,zui低可以檢測(cè)到100 個(gè)分子（10 - 21mol） ,靈敏度比RIA 或EA （酶免疫分析技術(shù)） 高1 至2 個(gè)數(shù)量級(jí);
    （2） 發(fā)光標(biāo)記物穩(wěn)定,有效期長(zhǎng)達(dá)數(shù)月甚至數(shù)年;
    （3） 檢測(cè)范圍寬,可達(dá)6 個(gè)數(shù)量級(jí);
    （4） 自動(dòng)化程度高,避免了手工操作帶來(lái)的誤差,提高了分析方法的精密度。近年來(lái)CLIA 發(fā)展迅猛,已經(jīng)成為一種成熟的、*的痕量/ 超痕量物質(zhì)檢測(cè)技術(shù),是目前發(fā)展和推廣應(yīng)用zui快的免疫分析方法之一。
    化學(xué)發(fā)光免疫分析根據(jù)標(biāo)記物不同,可分為標(biāo)記化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的化學(xué)發(fā)光免疫分析、標(biāo)記酶的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析和電化學(xué)發(fā)光免疫分析三大類。下面以化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法（Chemiluminescent Enzyme Immunoassay ,CL EIA） 為例說(shuō)明其在獸藥殘留分析中的應(yīng)用。由于獸藥殘留多是小分子化合物,在進(jìn)行免疫分析檢測(cè)時(shí)一般先要獲得獸藥的抗體（通?？蓪F藥小分子以半抗原形式,通過(guò)一定長(zhǎng)度的碳鏈連接分子與分子量大的載體（如蛋白質(zhì)） 以共價(jià)鍵耦聯(lián)制成人工抗原,再進(jìn)行免疫即獲得獸藥抗體） ,接著蛋白偶聯(lián)的獸藥（即合成的人工抗原） 與被檢物中的獸藥競(jìng)爭(zhēng)性地與獸藥抗體結(jié)合,發(fā)生抗原、抗體免疫反應(yīng),再通過(guò)化學(xué)發(fā)光進(jìn)行檢測(cè)。胥傳來(lái)等采用間接競(jìng)爭(zhēng)CL EIA 對(duì)豬尿樣中的鹽酸克倫特羅進(jìn)行了檢測(cè),與酶聯(lián)免疫吸附分析法（ EL ISA） 相比,EL ISA 雖然操作簡(jiǎn)單、快速,但其檢出限一般只有0. 1μg/ L 左右,難以達(dá)到檢測(cè)要求,且通常還需要進(jìn)一步采用氣相色譜2質(zhì)譜（ GC2MS） 或液相色譜2質(zhì)譜（LC2MS） 等方法進(jìn)行確證。而采用CL EIA 檢測(cè)鹽酸克倫特羅的靈敏度可達(dá)到0. 01μg/ L ,其線性范圍為0. 04～25. 8μg/ L 。因此,CL EIA 比EL ISA 具有更高的靈敏度。
3. 2 　液相色譜2化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法
    液相色譜法（ HPLC） 是20 世紀(jì)70 年代發(fā)展起來(lái)的一種、快速分離分析技術(shù)。目前HPLC使用的檢測(cè)器主要是紫外吸收檢測(cè)器（UV） 和熒光檢測(cè)器（FD） 。UV 檢測(cè)器只能檢測(cè)對(duì)紫外光有吸收的物質(zhì),且靈敏度低; FD 檢測(cè)器的靈敏度較UV 高,但多數(shù)獸藥殘留分子本身不發(fā)射熒光,需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜繁瑣的衍生化反應(yīng)?；瘜W(xué)發(fā)光/ 電化學(xué)發(fā)光（CL/ ECL） 作為HPLC 的檢測(cè)器（ HPLC2CL/ ECL） 已成為一種有效的痕量或超痕量檢測(cè)技術(shù)。Suzuki等采用HPLC2ECL 對(duì)雞肉組織中的氧氟沙星進(jìn)行了分析,檢出限達(dá)10 ng/ g。Wan 等依據(jù)土霉素、四環(huán)素和美他環(huán)素三種抗生素增強(qiáng)KMnO42Na2SO3-β-環(huán)糊精體系化學(xué)發(fā)光的原理,建立了三種抗生素的HPLC2CL 分析法,檢出限分別為0. 9 ng/ mL 、3. 0 ng/ mL 和5. 0 ng/ mL 。Katayama 等[15 ] 采用HPLC2CL 對(duì)血清中免疫抑制劑藥物環(huán)孢菌素A 進(jìn)行分析,檢出限達(dá)到5. 0 ×10 - 9 mol/ L 。
3. 3 　分子印跡2化學(xué)發(fā)光法
    分子印跡技術(shù)（Molecular Imprinting ,MIP） 是根據(jù)抗體2抗原或酶與底物的特異性識(shí)別原理建立起來(lái)的一種分離技術(shù),其核心是獲得在空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點(diǎn)上與某一分子（模板分子） 相匹配的聚合物,這是一類具有*分子識(shí)別能力的新型分離介質(zhì),被譽(yù)為“塑料抗體”。分子印跡聚合物（MIPs） 制備過(guò)程可分為三步:首先被印跡的分子與聚合物單體鍵合;其次是選擇適當(dāng)?shù)慕宦?lián)劑將聚合物單體交聯(lián)起來(lái)形成共聚合物;zui后再通過(guò)一定的方法將印跡分子從聚合物中提取出來(lái),從而得到MIPs。由于MIPs 留下了目標(biāo)分子的“印跡”或“記憶”,因此它對(duì)目標(biāo)分子表現(xiàn)出特異的選擇性和結(jié)合能力,能夠從復(fù)雜樣品中選擇性地識(shí)別和捕獲印跡分子或同印跡分子結(jié)構(gòu)相近的某一族或某一類化合物。MIPs 識(shí)別目標(biāo)分子的能力不僅可與抗體-抗原、酶-底物、受體2激素間的特異性識(shí)別相媲美,而且還具有抗體、酶、受體等所不具備的對(duì)特殊環(huán)境（如高溫、高壓、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、強(qiáng)離子強(qiáng)度等） 的耐受性和長(zhǎng)壽命。
    將分子印跡與化學(xué)發(fā)光聯(lián)用（分子印跡2化學(xué)發(fā)光） ,一方面可利用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)的高靈敏度;另一方面可結(jié)合分子印跡分離技術(shù)的預(yù)見(jiàn)性、識(shí)別性和實(shí)用性,彌補(bǔ)了化學(xué)發(fā)光分析選擇性較差的不足。二者的結(jié)合為化學(xué)發(fā)光分析法用于獸藥殘留分析提供了一種新的思路。杜建修等以撲熱息痛（ Paracetamol） 為目標(biāo)分子,丙烯酰胺為功能單體,乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑,采用分子印跡技術(shù)合成了對(duì)撲熱息痛具有選擇性識(shí)別能力的撲熱息痛分子印跡聚合物,并將此聚合物顆粒填充在化學(xué)發(fā)光流通池中作為分離富集介質(zhì)。當(dāng)撲熱息痛溶液流過(guò)流通池時(shí),目標(biāo)物被印跡聚合物選擇性俘獲,再與流過(guò)的鐵氰化鉀和魯米諾的混合液發(fā)生偶合化學(xué)發(fā)光,而導(dǎo)致體系的化學(xué)發(fā)光信號(hào)降低。結(jié)果表明,該方法對(duì)撲熱息痛的檢出限為3 ×10 - 6 mol/ L ,并成功地用于尿樣中撲熱息能的分析。該課題組還采用類似的方法,建立了安乃近的分子印跡-化學(xué)發(fā)光分析法,檢出限達(dá)4 ×10 - 8 mol/ L 。Zhou 等將克倫特羅分子印跡聚合物裝在流通池中作化學(xué)發(fā)光傳感器在線富集克倫特羅,不僅顯著地提高了克倫特羅檢測(cè)的靈敏度和選擇性,而且避免了克倫特羅在化學(xué)發(fā)光檢測(cè)中的嚴(yán)重基質(zhì)干擾。另外,分子印跡技術(shù)還可以與固相萃?。⊿PE） 結(jié)合,制備分子印跡2固相萃取柱（MISPE） ,解決了常規(guī)SPE 中吸附劑與被萃取物之間作用力是非特異性結(jié)合的問(wèn)題。MISPE 不僅可以離線制備,還可以在線原位合成。原位法比離線法制備的MISPE 整體柱具有更好的多孔性、滲透性和穩(wěn)定性,鄒漢法等已證明原位MISPE 的柱效遠(yuǎn)高于離線MISPE 的柱效。MISPE 可用于分離和富集動(dòng)物性食品中的殘留獸藥,既能用于單個(gè)獸藥的殘留分離,也能用于多殘留的篩選。而采用原位聚合法直接在色譜柱內(nèi)合成MISPE 整體柱,結(jié)合化學(xué)發(fā)光在線檢測(cè),更顯示分子印跡技術(shù)在獸藥殘留分析中的廣闊應(yīng)用空間。
    因此,分子印跡2化學(xué)發(fā)光將成為獸藥殘留分析領(lǐng)域的重要研究方向之一。
3. 4 　毛細(xì)管電泳2化學(xué)發(fā)光法
    毛細(xì)管電泳（Capillary Elect rop horesis ,CE） ,又稱毛細(xì)管電泳（ HPCE） ） ,它是20 世紀(jì)80 年代興起的一種新型、分離技術(shù),是近年來(lái)發(fā)展zui快的分析化學(xué)研究領(lǐng)域之一。它是以電場(chǎng)力為驅(qū)動(dòng)力,以毛細(xì)管為分離通道,根據(jù)樣品中待測(cè)物或其離子間淌度和分離行為上的差異,而實(shí)現(xiàn)分離的一種液相分離技術(shù)。在毛細(xì)管電泳分析中,檢測(cè)器靈敏度是CE 的關(guān)鍵。迄今為止,除了原子吸收和紅外光譜未用于CE 的檢測(cè)外,其它檢測(cè)手段均已用于CE ,而其中CL/ ECL 檢測(cè)技術(shù)zui引人注目。Tsukagoshi 等證明用CE-CL 檢測(cè)血紅蛋白的檢出限比CE-UV 降低4 個(gè)數(shù)量級(jí)。汪爾康課題組對(duì)Ru （ bipy） 2 +3 的ECL 與CE 聯(lián)用進(jìn)行了系統(tǒng)的研究,與西安瑞邁公司合作研制出了CE-ECL 儀,并已成功地用于臨床藥物分析。
    近幾年發(fā)表的有關(guān)CE-CL/ ECL 的文章數(shù)量呈快速增長(zhǎng)之勢(shì),充分顯示出CE-CL/ ECL 在分析檢測(cè)領(lǐng)域中的巨大應(yīng)用潛力。
3. 5 　微流控芯片化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)
    微流控芯片是將整個(gè)化驗(yàn)室的功能,從樣品制備到分離、檢測(cè)的整個(gè)分析過(guò)程都集成在一個(gè)只有幾平方厘米的芯片上進(jìn)行,其顯著優(yōu)點(diǎn)是:
    （1） 試劑消耗大大減少到微升甚至納升、皮升級(jí),從而降低了分析成本,減少了對(duì)環(huán)境的污染;
    （2） 分析速度快;
    （3） 應(yīng)用范圍廣泛（從原則上講,它適合于從核酸、蛋白質(zhì)大分子到有機(jī)、無(wú)機(jī)等小分子的檢測(cè)） ;
    （4） 攜帶方便,為分析測(cè)試技術(shù)的普及創(chuàng)造了條件。
    在微流控芯片中,zui被看好的高靈敏度檢測(cè)技術(shù)主要包括電化學(xué)、激光誘導(dǎo)熒光、生物和化學(xué)發(fā)光技術(shù),而其中的ECL 由于兼有電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)而更具優(yōu)勢(shì)。CL/ ECL 與微流控芯片聯(lián)用是當(dāng)前化學(xué)發(fā)光分析研究的一個(gè)新熱點(diǎn)。Zhao 等[以Indium Tin Oxide （ ITO） 作工作電極,采用微芯片CE-ECL 系統(tǒng)對(duì)尿樣中的林肯霉素（Lincomycin） 進(jìn)行了檢測(cè),整個(gè)分析過(guò)程可在40 s 完成,檢出限達(dá)9. 0 ×10 - 6 mol/ L 。這種方法可以直接用于尿液中林肯霉素的檢測(cè),無(wú)需前處理,為臨床和制藥領(lǐng)域林肯霉素的檢測(cè)提供了一種全新的方法。Greenwood 等采用化學(xué)發(fā)光-微全分析系統(tǒng)（Micro Total Analysis Systems ,即μTAS） ,以Ru （ bipy） 2 +3-Ce （ Ⅳ） 為化學(xué)發(fā)光體系,通過(guò)副壓泵系統(tǒng)進(jìn)樣,對(duì)藥物分子阿托品（At ropine） 和派魚替啶（ Pet hidine） 進(jìn)行了分析,檢出限分別為3. 8 ×10 - 9 和7. 7 ×10 - 8 mol/ L 。μTAS 芯片與化學(xué)發(fā)光檢測(cè)聯(lián)用有*的應(yīng)用前景。
    微流控芯片的集成化、微型化和自動(dòng)化等特點(diǎn)符合獸藥殘留分析發(fā)展的要求,因此,開(kāi)展這一新技術(shù)在獸藥殘留分析領(lǐng)域的研究,不僅可以為我國(guó)動(dòng)物性食品安全監(jiān)測(cè)和控制提供新的,而且對(duì)推動(dòng)微流控芯片分析技術(shù)在獸藥殘留分析領(lǐng)域中的應(yīng)用也具有十分重要的意義。

4 　結(jié)論
    目前,發(fā)達(dá)國(guó)家在獸藥殘留分析方面呈現(xiàn)兩大趨勢(shì):一是殘留指標(biāo)*值的逐步降低;二是檢測(cè)技術(shù)趨向于高技術(shù)化、系列化、速測(cè)化、便攜化。因此,化學(xué)發(fā)光聯(lián)用技術(shù)在獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域中的研究和應(yīng)用具有廣闊的空間,而微流控芯片與化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)聯(lián)用將是其中應(yīng)用潛力的研究方向。隨著微流控芯片分析技術(shù)不斷開(kāi)發(fā)和完善,將催生出新一代既具有當(dāng)今實(shí)驗(yàn)室大型分析儀器的分析性能,又具有使用方便、檢測(cè)快速、價(jià)格低廉的食品安全檢測(cè)方法和儀器。