你知道如何正確操作發(fā)酵罐嗎？

一、操作前：準(zhǔn)備與滅菌（核心前提 —— 杜絕雜菌污染）

1. 設(shè)備與物料檢查

• 發(fā)酵罐本體：檢查罐壁、攪拌槳（或氣升式導(dǎo)流筒）、密封件（如機(jī)械密封、O 型圈）是否完好，無(wú)破損、變形或滲漏；確認(rèn)溫度傳感器、pH 電極、溶氧電極（DO 電極）、壓力傳感器等探頭安裝牢固，無(wú)松動(dòng)或污染。

• 管路系統(tǒng)：檢查進(jìn)料管（培養(yǎng)基、補(bǔ)料）、進(jìn)氣 / 排氣閥（無(wú)菌空氣、尾氣處理）、取樣管、放料管的閥門(mén)是否靈活，管路無(wú)堵塞、老化；確認(rèn)蒸汽管路（用于滅菌）壓力正常（通常 0.3-0.5MPa），無(wú)泄漏。

• 輔助系統(tǒng)：檢查無(wú)菌空氣系統(tǒng)（空壓機(jī)、過(guò)濾器、除濕裝置）是否正常，空氣過(guò)濾器（前置、除菌級(jí)）是否在有效期內(nèi)；確認(rèn)溫控系統(tǒng)（加熱 / 冷卻夾套、循環(huán)水）、攪拌電機(jī)、蠕動(dòng)泵（補(bǔ)料 / 消泡劑）運(yùn)行正常。

• 物料準(zhǔn)備：培養(yǎng)基需按配方精準(zhǔn)配制（如碳源、氮源、微量元素、pH 調(diào)節(jié)劑），并經(jīng)預(yù)過(guò)濾（如 0.22μm 濾膜，去除粗顆粒）；菌種需提前活化（如斜面培養(yǎng)→種子液擴(kuò)大培養(yǎng)），確?；钚耘c純度。

2. 罐體與管路滅菌（核心步驟 —— 濕熱滅菌為主）

1. 加液與排氣：將配制好的培養(yǎng)基（體積不超過(guò)罐體總?cè)莘e的 70%，避免發(fā)酵時(shí)溢出）加入發(fā)酵罐，關(guān)閉所有閥門(mén)，打開(kāi)排氣閥和蒸汽進(jìn)口閥，緩慢通入蒸汽，排出罐內(nèi)和管路中的冷空氣

2. 升溫與保壓：當(dāng)排氣閥排出純蒸汽（無(wú)冷凝水、蒸汽連續(xù)均勻）時(shí)，關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)通蒸汽，使罐內(nèi)壓力升至0.1-0.12MPa（對(duì)應(yīng)溫度 121℃），同時(shí)開(kāi)啟攪拌（低速，100-200rpm，確保培養(yǎng)基受熱均勻）。

3. 恒溫滅菌：維持 121℃、0.1MPa 壓力，根據(jù)培養(yǎng)基成分和罐體體積保溫滅菌，常規(guī)時(shí)間為20-30 分鐘（含管路滅菌，需打開(kāi)各支管閥門(mén)，讓蒸汽流經(jīng)所有管路）；若培養(yǎng)基含熱敏性成分（如維生素、酶），可采用 “低溫長(zhǎng)時(shí)” 滅菌（如 115℃、0.06MPa，30-40 分鐘）。

4. 降溫與保壓：滅菌結(jié)束后，關(guān)閉蒸汽閥，打開(kāi)排氣閥緩慢泄壓（泄壓速度≤0.01MPa / 分鐘，避免壓力驟降導(dǎo)致培養(yǎng)基暴沸），同時(shí)開(kāi)啟冷卻系統(tǒng)（如夾套通冷卻水），將培養(yǎng)基溫度降至發(fā)酵設(shè)定溫度（如細(xì)菌 30-37℃、酵母菌 28-30℃、真菌 25-30℃）。

5. 無(wú)菌保護(hù)：降溫過(guò)程中，需向罐內(nèi)通入無(wú)菌空氣（維持罐內(nèi)微正壓，0.02-0.05MPa，防止外界雜菌進(jìn)入），直至溫度穩(wěn)定在設(shè)定值。

3. 探頭與附件滅菌

• 電極滅菌：溫度傳感器、pH 電極、DO 電極需隨罐體一同滅菌（耐高溫型號(hào)）；若為不耐高溫電極（如部分 pH 電極），需在滅菌后采用 “無(wú)菌操作” 插入罐體，插入前需用 75% 乙醇擦拭消毒，再用無(wú)菌生理鹽水沖洗。

• 取樣管 / 補(bǔ)料管滅菌：滅菌后需關(guān)閉取樣閥、補(bǔ)料閥，保持管路內(nèi)無(wú)菌狀態(tài)，使用前需先排放少量管路內(nèi)的冷凝水或殘留蒸汽，再進(jìn)行取樣或補(bǔ)料。

二、操作中：發(fā)酵過(guò)程控制（核心環(huán)節(jié) —— 參數(shù)精準(zhǔn)調(diào)控）

1. 無(wú)菌接種（杜絕污染的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)）

1. 接種前，用 75% 乙醇擦拭發(fā)酵罐接種口（或接種塞），并開(kāi)啟接種口周?chē)淖贤鉄粝?30 分鐘（消毒后關(guān)閉紫外燈，通風(fēng) 15 分鐘）。

2. 打開(kāi)接種口，快速將活化好的種子液（接種量通常為 5%-10%，根據(jù)菌種生長(zhǎng)速度調(diào)整）倒入罐內(nèi)，或通過(guò)無(wú)菌移液管 / 蠕動(dòng)泵注入，全程動(dòng)作迅速，避免空氣長(zhǎng)時(shí)間接觸。

3. 接種后，關(guān)閉接種口，確保密封，維持罐內(nèi)微正壓（0.02-0.05MPa），開(kāi)啟攪拌（按設(shè)定轉(zhuǎn)速，如 200-500rpm，根據(jù)菌種需氧性調(diào)整）和無(wú)菌空氣供應(yīng)（通氣量通常為 0.5-2vvm，即每小時(shí)通入的空氣體積為罐體體積的 0.5-2 倍）。

2. 關(guān)鍵參數(shù)監(jiān)控與調(diào)節(jié)

3. 取樣與過(guò)程分析

• 無(wú)菌取樣：取樣前，用 75% 乙醇擦拭取樣口，打開(kāi)取樣閥，先排放 2-3mL 管路內(nèi)的殘留液體（避免管路污染樣品），再用無(wú)菌離心管收集樣品（體積 5-10mL），取樣后關(guān)閉取樣閥，并用無(wú)菌生理鹽水沖洗取樣管。

• 樣品分析：及時(shí)檢測(cè)樣品的關(guān)鍵指標(biāo)，判斷發(fā)酵進(jìn)程：

• 微生物生長(zhǎng)：測(cè)定菌體量（如 OD600 吸光度、干重法）、活菌數(shù)（平板計(jì)數(shù)法）；

• 營(yíng)養(yǎng)消耗：檢測(cè)殘?zhí)牵ㄈ?DNS 法、高效液相色譜）、氨基氮（如茚三酮法）；

• 產(chǎn)物合成：根據(jù)產(chǎn)物類型檢測(cè)（如抗生素用抑菌圈法、酶用活性測(cè)定、有機(jī)酸用滴定法）。

• 調(diào)整策略：若分析發(fā)現(xiàn)參數(shù)異常（如殘?zhí)沁^(guò)低、菌體量增長(zhǎng)緩慢），需及時(shí)調(diào)整工藝（如增加補(bǔ)料量、提高通氣量），避免發(fā)酵失敗。

三、操作后：發(fā)酵終止與設(shè)備清洗（核心目標(biāo) —— 避免殘留污染）

1. 發(fā)酵終止與產(chǎn)物收集

• 終止操作：關(guān)閉攪拌、無(wú)菌空氣供應(yīng)，若需快速降溫，可加大冷卻水流速；對(duì)于需滅活的發(fā)酵液，可通入蒸汽（100℃，10 分鐘）或加入滅活劑（如甲醛，按需使用）。

• 產(chǎn)物收集：打開(kāi)放料閥，將發(fā)酵液轉(zhuǎn)入后續(xù)處理設(shè)備（如離心分離機(jī)、過(guò)濾機(jī)、提取罐），收集菌體（如酵母、益生菌）或上清液（如酶、抗生素）；放料后關(guān)閉放料閥，避免殘留液體滋生雜菌。

2. 設(shè)備清洗與維護(hù)

• 初步清洗：向罐內(nèi)加入純化水（或稀堿溶液，如 0.5% NaOH，去除蛋白質(zhì)殘留），開(kāi)啟攪拌（200-300rpm），清洗 10-15 分鐘，然后通過(guò)放料管排出清洗液；重復(fù) 2-3 次，直至清洗液澄清，無(wú)培養(yǎng)基殘留。

• 探頭與管路清洗：拆卸 pH 電極、DO 電極，用純化水沖洗后浸泡在保護(hù)液中（如 pH 電極浸泡在 3mol/L KCl 溶液，DO 電極浸泡在飽和亞硫酸鈉溶液）；用純化水沖洗取樣管、補(bǔ)料管、進(jìn)氣 / 排氣管路，確保無(wú)殘留。

• 干燥與檢查：清洗后打開(kāi)罐蓋和所有閥門(mén)，通入壓縮空氣（或無(wú)菌空氣）吹干罐內(nèi)和管路，避免潮濕環(huán)境滋生霉菌；檢查密封件、探頭、閥門(mén)是否完好，若有損壞及時(shí)更換；記錄本次發(fā)酵的所有參數(shù)（如溫度、pH、產(chǎn)物濃度），歸檔保存。

• 長(zhǎng)期存放：若長(zhǎng)期不使用，需在罐內(nèi)涂抹少量無(wú)菌凡士林（保護(hù)罐壁），關(guān)閉所有閥門(mén)，套上防塵罩，定期檢查設(shè)備狀態(tài)。

發(fā)酵罐操作流程的五個(gè)步驟