ELISA試劑盒競爭法操作的步驟與注意事項

　　以下是ELISA競爭法操作的標(biāo)準(zhǔn)化步驟及關(guān)鍵注意事項，結(jié)合實驗規(guī)范與常見問題解決方案整理：

　　一、操作步驟?

　　試劑與樣本準(zhǔn)備?

　　標(biāo)準(zhǔn)品按說明書要求進行倍比稀釋(如5倍梯度稀釋)，避免渦旋震蕩導(dǎo)致蛋白變性?。

　　樣本需離心澄清(10,000×g 5分鐘)，避免溶血或細菌污染干擾結(jié)果?。

　　競爭反應(yīng)?

　　將樣本與預(yù)稀釋的特異性抗體工作液混合(抗體僅識別目標(biāo)抗原)，37℃孵育1小時?。

　　孵育時覆蓋封板膜，防止蒸發(fā)和溫度不均?。

　　洗滌與酶結(jié)合?

　　洗板3次(含0.05% Tween-20的洗滌液)，去除未結(jié)合物質(zhì)?。

　　酶結(jié)合物工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用(15分鐘內(nèi)使用)，37℃孵育50分鐘?。

　　顯色與讀數(shù)?

　　加入TMB底物避光反應(yīng)20分鐘，終止液需在5分鐘內(nèi)加入并讀數(shù)(450nm波長)?。

　　二、關(guān)鍵注意事項?

　　加樣規(guī)范?

　　槍頭懸空加至孔底，避免觸碰孔壁或產(chǎn)生氣泡?。

　　復(fù)孔加樣需控制時間差(≤5分鐘)，減少操作誤差?。

　　顯色異常處理?

　　無顯色?：檢查底物是否避光保存或酶標(biāo)抗體是否失效?。

　　高背景?：增加封閉時間(1-2小時)或洗滌次數(shù)(≥5次)?。

　　假陽性/假陰性控制?

　　溶血樣本需離心處理，類風(fēng)濕因子陽性樣本添加RF阻斷劑?。

　　競爭法需嚴(yán)格按“樣本+抗體→酶標(biāo)物”順序操作，避免順序錯誤導(dǎo)致假陰性?。

　　三、擴展資源?

　　注：不同品牌試劑盒參數(shù)可能差異較大，建議以實際說明書為準(zhǔn)。

　　注：以上僅供參考，不作為實際數(shù)據(jù)，實驗需嚴(yán)格遵循說明或咨詢技術(shù)老師。 ELISA試劑盒

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