ELISA實(shí)驗(yàn)樣本處理常見錯(cuò)誤及解決方案

　　一、樣本采集與保存錯(cuò)誤

　　抗凝劑選擇不當(dāng)?

　　錯(cuò)誤：使用肝素鈉抗凝血漿時(shí)未充分混勻，導(dǎo)致局部凝血或纖維蛋白析出。

　　解決：EDTA抗凝血漿需立即顛倒混勻5-8次，避免靜置?。

　　保存條件不規(guī)范?

　　錯(cuò)誤：血清/血漿反復(fù)凍融(>3次)或長(zhǎng)期置于4℃未分裝，導(dǎo)致蛋白降解。

　　解決：分裝后-80℃保存，避免反復(fù)凍融;短期檢測(cè)可2-8℃保存≤7天?。

　　溶血或脂血樣本未處理?

　　錯(cuò)誤：直接使用溶血樣本(血紅蛋白釋放過(guò)氧化物酶干擾顯色)或高脂血樣本(非特異性吸附)。

　　解決：離心后取上清，溶血樣本需稀釋或超濾處理?。

　　二、樣本預(yù)處理錯(cuò)誤

　　離心參數(shù)錯(cuò)誤?

　　錯(cuò)誤：離心速度過(guò)低(<2000×g)或時(shí)間不足(<15分鐘)，導(dǎo)致殘留細(xì)胞碎片。

　　解決：3000×g離心20分鐘，4℃操作?。

　　稀釋比例不當(dāng)?

　　錯(cuò)誤：高濃度樣本未預(yù)實(shí)驗(yàn)確定稀釋倍數(shù)，超出檢測(cè)線性范圍。

　　解決：通過(guò)棋盤滴定法確定最佳稀釋比例(如1:5至1:20)?。

　　裂解液污染?

　　錯(cuò)誤：使用含RIPA或SDS的裂解液處理樣本，殘留去垢劑抑制酶活性。

　　解決：改用PBS或生理鹽水勻漿，超濾去除小分子干擾物?。

　　三、操作流程錯(cuò)誤

　　加樣交叉污染?

　　錯(cuò)誤：同一槍頭重復(fù)吸取不同樣本，導(dǎo)致假陽(yáng)性。

　　解決：使用帶濾芯槍頭，每孔更換吸頭?。

　　樣本未平衡至室溫?

　　錯(cuò)誤：冷藏樣本直接加樣，導(dǎo)致反應(yīng)速率不均。

　　解決：室溫平衡30分鐘后再檢測(cè)?。

　　防腐劑干擾?

　　錯(cuò)誤：樣本含疊氮鈉(抑制HRP酶活性)或硫柳汞(干擾抗原-抗體結(jié)合)。

　　解決：更換無(wú)防腐劑保存液或透析去除?。

　　四、特殊樣本處理問(wèn)題

　　組織樣本處理不當(dāng)?

　　錯(cuò)誤：未充分勻漿或離心后上清含脂肪顆粒。

　　解決：加入蛋白酶抑制劑，4℃勻漿后12000×g離心10分鐘?。

　　尿液/腦脊液樣本污染?

　　錯(cuò)誤：未過(guò)濾或離心去除細(xì)菌/顆粒物。

　　解決：0.22 μm濾膜過(guò)濾或高速離心(10000×g)?。

　　細(xì)胞培養(yǎng)上清處理遺漏?

　　錯(cuò)誤：未去除細(xì)胞碎片或代謝產(chǎn)物(如乳酸)。

　　解決：離心后取上清，必要時(shí)超濾濃縮?。

　　五、關(guān)鍵預(yù)防措施

　　標(biāo)準(zhǔn)化操作?：嚴(yán)格記錄樣本處理時(shí)間、溫度及離心參數(shù)?。

　　質(zhì)控樣本?：每批次實(shí)驗(yàn)加入已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證線性范圍?。

　　設(shè)備校準(zhǔn)?：定期校驗(yàn)離心機(jī)轉(zhuǎn)速及移液器精度?。

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