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離心機(jī)技術(shù)——沉降系數(shù)的測(cè)定

來源:   2007年02月07日 12:04  
  沉降系數(shù)測(cè)定是分析離心機(jī)zui主要的用途。通常只需要幾十毫克甚至幾十微克樣品,配制成1~2毫 升溶液,裝入分析池,以幾小時(shí)的分析離心,就可以獲得一系列的樣品離心沉降圖。根據(jù)沉降圖可以作樣品所含組分的定性分析,亦可以測(cè)定各組分的沉降系數(shù)和估計(jì)分子大小,作樣品純度檢定和不均一性測(cè)定,以組分的相對(duì)含量測(cè)定。   
 1、原理 

  沉降系數(shù)的測(cè)定原理就是在恒定的離心力場(chǎng)下測(cè)定樣品顆粒的沉降速度。因?yàn)闃悠奉w粒很小,不能直接看到它們的沉降運(yùn)動(dòng),所以把離心時(shí)樣品顆粒的界面移動(dòng)速度看作是樣品顆粒的平均沉降速度。通常使用Schlieren和吸收光學(xué)系統(tǒng)來記錄界面沉降圖。在沉降圖中樣品界面一般表現(xiàn)為一個(gè)對(duì)稱的峰,峰的zui高點(diǎn)代表界面位置。通常沉降系數(shù)測(cè)量精度為±2%,但是如果面界圖型表現(xiàn)為不對(duì)稱峰型,或希望沉降系數(shù)測(cè)量精度達(dá)到±1%或更小的情況時(shí),按峰的zui高點(diǎn)作為界面位置就不夠了這時(shí)應(yīng)該使用二階距法計(jì)算界面位置。 

    2、沉降系數(shù)測(cè)定實(shí)例 

 ?、艠悠罚号Q灏椎鞍?nbsp;  
 
  ⑵樣品溶液與離心:按0.6%濃度將牛血清白蛋白溶于0.14M NaCl、0.01M磷酸緩沖液中,pH7.0。用12mm厚雙槽分析池,一邊加入溶液一邊加入溶劑,約各0.3ml。分析池與平衡池平衡重量,使平衡池比分析池輕0.5g以內(nèi),然后分別裝入分析轉(zhuǎn)頭。分析轉(zhuǎn)頭裝于分析離心為什么,關(guān)轉(zhuǎn)動(dòng)腔,抽真空。開Schlieren光光源,選擇工作速度一60000轉(zhuǎn)/分,離心室溫。轉(zhuǎn)動(dòng)腔達(dá)到真空后離以機(jī)開始運(yùn)轉(zhuǎn)加速,此時(shí)在觀察窗口可以看到離心圖型。達(dá)到工作速度后即為恒速離心。待看到樣品峰的后即可以6分鐘間隔照相,共照6張。照完相即可關(guān)機(jī),取出樣品液,清理轉(zhuǎn)頭和分析池。照相用強(qiáng)反差顯影沖洗后即得Schlieren光路沉降圖形照片。

 ?、浅两祱D象測(cè)量:Schlieren沉降圖可以用比長(zhǎng)儀,讀數(shù)顯微鏡,或投影儀測(cè)量。要求測(cè)量的橫向量程為6cm,測(cè)量精度應(yīng)優(yōu)于10μm。通常讀數(shù)顯微鏡已能滿足要求。投影儀可以使圖象放大于屏幕上,讀測(cè)比較容易,眼睛不易疲勞。測(cè)量時(shí)把沉降圖象的底片放于測(cè)量?jī)x器上,使液面的垂直線與測(cè)量?jī)x中的垂直線重合,然后用十字標(biāo)線依次測(cè)量?jī)?nèi)參孔,液面,界面峰尖,和外參考孔的位置,每個(gè)圖象至少讀測(cè)三次,取平均值。依次把每個(gè)圖象依同樣方法測(cè)量,把數(shù)據(jù)列成下表。

  表  0.6%牛血清白蛋白沉降圖測(cè)量值 

照相號(hào)
x 1 (mm)
x 2 (mm)
x 3 (mm)
x 4 (mm)
(x 3 -x 1)/a
log[5.65+(x 3 -x1)/a]
1
45.426
37.626
33.807
13.810
0.6125
0.7967
2
45.640
37.830
33.351
13.420
0.6485
0.7992
3
45.890
38.070
32.895
13.663
0.6854
0.8017
4
45.733
37.921
32.163
13.523
0.7161
0.8039
5
45.802
38.000
31.580
13.593
0.7507
0.8062
6
46.009
38.211
31.172
13.800
0.7830
0.8084

    (4)沉降系數(shù)S的計(jì)算:沉降圖測(cè)量完,先檢查每一張圖和第六張圖的x 2 -x 1 值,二張圖的x 2 -x 1 值的差應(yīng)該小于界面峰位置的測(cè)量誤差。實(shí)測(cè)x 2 -x 1 的差值為0.002,說明液面在離心30分鐘內(nèi)變動(dòng)為 0.002mm。界面峰在30分鐘內(nèi)移動(dòng)距離是第六號(hào)圖的x 1 -x 3 減*號(hào)圖的 x 1 -x 3 ,是3.208mm,其峰位測(cè)量意味著允許為0.03??蓛?nèi)陸液面變動(dòng)0.002mm遠(yuǎn)小于峰位測(cè)量*.03mm,說明離心時(shí)沒有發(fā)生漏液。

  按a=(x 4 -x 1) /1.7求算光路對(duì)分析池的放大倍數(shù),然后按(x 3 -x 1) /a求算界面峰離開內(nèi)參考孔的實(shí)際距離,再按x=5.65+(x 3 -x 1) /a求算界面峰離開旋轉(zhuǎn)中心的實(shí)際距離,再由對(duì)數(shù)表求算logx植,計(jì)算數(shù)據(jù)亦列于表5中。 

    3、離心圖象的分析 

  當(dāng)離心剛開始時(shí)如果見到有快速沉降的峰,幾分鐘內(nèi)就到達(dá)分析池底部,一般多是由于樣品發(fā)生部分聚合形成快速沉降的高聚物,如蛋白質(zhì)樣品液遇到某些變性因素時(shí)會(huì)部分變性而沉淀。離心達(dá)速后樣品的的記心圖象顯示一個(gè)對(duì)稱的峰形,一般可以認(rèn)為樣品是離心均一的。但是對(duì)樣品的真正均一性還應(yīng)用其他方法進(jìn)一步檢測(cè),如電泳,層析等。某些混合樣品偶然亦會(huì)給出一個(gè)對(duì)稱峰的。峰形通常會(huì)隨時(shí)間而擴(kuò)展,這是由于樣品擴(kuò)散的結(jié)
果。但如果峰形擴(kuò)展很快,則該樣品可能是多分散性的。如果離心圖象中表現(xiàn)幾個(gè)峰,說明樣品中有幾個(gè)組分,每一個(gè)峰代表相應(yīng)組分的沉降界面,因此可以測(cè)定每一個(gè)組分的沉降系數(shù)值。根據(jù)峰的面積可以測(cè)量組分的濃度值。

  有時(shí)離心的圖象表現(xiàn)出一個(gè)不對(duì)稱的峰,這可能是由于下列幾種情況所致。①幾個(gè)沉降系數(shù)接近的組分峰形重疊,②樣品是多分散性的,其分子量分不均勻,③某些相互作用強(qiáng)的高分子,其沉降速度對(duì)濃度依賴很大,如DNA,多糖分子,若測(cè)定于高濃度,在界面區(qū)由于濃度變化造成沉降速度不一致而致峰形呈不對(duì)稱分布。這類樣品在更大濃度時(shí)甚至?xí)纬梢环浅<怃J的界面,在離心沉降圖中表現(xiàn)成一根垂直線,看不到任何峰形。根據(jù)這種圖形測(cè)定沉降系數(shù)誤差將很大。通常這類樣品應(yīng)該測(cè)定于很稀的濃度,此條件下分子相互作用變小,界面擴(kuò)展的峰形,才可以測(cè)到正確的沉降系數(shù)。 

   4、樣品的純度和濃度測(cè)定 

  分析離心機(jī)可以測(cè)定樣品的純度和濃度,這亦是分析離心用途。通常樣品的離心圖形表現(xiàn)一個(gè)對(duì)稱峰形時(shí),可認(rèn)為該樣品是離心均一的。但是在作純度測(cè)定時(shí)還要注意樣品的測(cè)定濃度,應(yīng)該使樣品測(cè)定濃度大于測(cè)定方法的靈敏度一百倍以上,測(cè)定才有意義。譬如Schlieren光路對(duì)該樣品測(cè)定靈敏度為0.1mg/ml,那么該樣品測(cè)純度時(shí)的濃度應(yīng)該是90mg/ml。假如選用樣1mg/ml濃度測(cè)定,沉降圖形即使表現(xiàn)單一峰,仍不能確定其純度是0%還是99%。如果樣品是多組分的,離心圖中表現(xiàn)幾個(gè)峰,根據(jù)每個(gè)峰的面積與所有峰的總面積的比值可以得到每個(gè)組分的相對(duì)濃度值。在計(jì)算時(shí)應(yīng)該考慮輻射稀釋效應(yīng),即把各個(gè)組分的面積值根據(jù)其所在位置用輻射稀釋公式校正到液面處的值,然后計(jì)算相對(duì)。還要注意這樣的濃度估測(cè)是建立在各個(gè)組分具有相同的折射率比值的假設(shè)基礎(chǔ)上的。根據(jù)峰形面積結(jié)合該組分的濃度與折射率比值和儀器常數(shù)還可以計(jì)算該組掃的濃度值。 

    5、帶狀沉降法 

  帶狀沉降法類似于速率區(qū)帶離心法。方法使用合成界面池,在池中預(yù)先加入0.55ml的1M NaCl溶液,然后地2000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速下鋪上0.01ml樣品液,然后加速到30000轉(zhuǎn)/分,用吸收光路記錄樣品沉降圖形。由于NaNl向樣,品帶擴(kuò)散形成一密度梯度區(qū),可以穩(wěn) 
 

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