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表 0.6%牛血清白蛋白沉降圖測(cè)量值
照相號(hào) | x 1 (mm) | x 2 (mm) | x 3 (mm) | x 4 (mm) | (x 3 -x 1)/a | log[5.65+(x 3 -x1)/a] |
1 | 45.426 | 37.626 | 33.807 | 13.810 | 0.6125 | 0.7967 |
2 | 45.640 | 37.830 | 33.351 | 13.420 | 0.6485 | 0.7992 |
3 | 45.890 | 38.070 | 32.895 | 13.663 | 0.6854 | 0.8017 |
4 | 45.733 | 37.921 | 32.163 | 13.523 | 0.7161 | 0.8039 |
5 | 45.802 | 38.000 | 31.580 | 13.593 | 0.7507 | 0.8062 |
6 | 46.009 | 38.211 | 31.172 | 13.800 | 0.7830 | 0.8084 |
(4)沉降系數(shù)S的計(jì)算:沉降圖測(cè)量完,先檢查每一張圖和第六張圖的x 2 -x 1 值,二張圖的x 2 -x 1 值的差應(yīng)該小于界面峰位置的測(cè)量誤差。實(shí)測(cè)x 2 -x 1 的差值為0.002,說明液面在離心30分鐘內(nèi)變動(dòng)為 0.002mm。界面峰在30分鐘內(nèi)移動(dòng)距離是第六號(hào)圖的x 1 -x 3 減*號(hào)圖的 x 1 -x 3 ,是3.208mm,其峰位測(cè)量意味著允許為0.03??蓛?nèi)陸液面變動(dòng)0.002mm遠(yuǎn)小于峰位測(cè)量*.03mm,說明離心時(shí)沒有發(fā)生漏液。
按a=(x 4 -x 1) /1.7求算光路對(duì)分析池的放大倍數(shù),然后按(x 3 -x 1) /a求算界面峰離開內(nèi)參考孔的實(shí)際距離,再按x=5.65+(x 3 -x 1) /a求算界面峰離開旋轉(zhuǎn)中心的實(shí)際距離,再由對(duì)數(shù)表求算logx植,計(jì)算數(shù)據(jù)亦列于表5中。
3、離心圖象的分析
當(dāng)離心剛開始時(shí)如果見到有快速沉降的峰,幾分鐘內(nèi)就到達(dá)分析池底部,一般多是由于樣品發(fā)生部分聚合形成快速沉降的高聚物,如蛋白質(zhì)樣品液遇到某些變性因素時(shí)會(huì)部分變性而沉淀。離心達(dá)速后樣品的的記心圖象顯示一個(gè)對(duì)稱的峰形,一般可以認(rèn)為樣品是離心均一的。但是對(duì)樣品的真正均一性還應(yīng)用其他方法進(jìn)一步檢測(cè),如電泳,層析等。某些混合樣品偶然亦會(huì)給出一個(gè)對(duì)稱峰的。峰形通常會(huì)隨時(shí)間而擴(kuò)展,這是由于樣品擴(kuò)散的結(jié)果。但如果峰形擴(kuò)展很快,則該樣品可能是多分散性的。如果離心圖象中表現(xiàn)幾個(gè)峰,說明樣品中有幾個(gè)組分,每一個(gè)峰代表相應(yīng)組分的沉降界面,因此可以測(cè)定每一個(gè)組分的沉降系數(shù)值。根據(jù)峰的面積可以測(cè)量組分的濃度值。
有時(shí)離心的圖象表現(xiàn)出一個(gè)不對(duì)稱的峰,這可能是由于下列幾種情況所致。①幾個(gè)沉降系數(shù)接近的組分峰形重疊,②樣品是多分散性的,其分子量分布不均勻,③某些相互作用強(qiáng)的高分子,其沉降速度對(duì)濃度依賴很大,如DNA,多糖分子,若測(cè)定于高濃度,在界面區(qū)由于濃度變化造成沉降速度不一致而致峰形呈不對(duì)稱分布。這類樣品在更大濃度時(shí)甚至?xí)纬梢环浅<怃J的界面,在離心沉降圖中表現(xiàn)成一根垂直線,看不到任何峰形。根據(jù)這種圖形測(cè)定沉降系數(shù)誤差將很大。通常這類樣品應(yīng)該測(cè)定于很稀的濃度,此條件下分子相互作用變小,界面擴(kuò)展的峰形,才可以測(cè)到正確的沉降系數(shù)。
4、樣品的純度和濃度測(cè)定
分析離心機(jī)可以測(cè)定樣品的純度和濃度,這亦是分析離心用途。通常樣品的離心圖形表現(xiàn)一個(gè)對(duì)稱峰形時(shí),可認(rèn)為該樣品是離心均一的。但是在作純度測(cè)定時(shí)還要注意樣品的測(cè)定濃度,應(yīng)該使樣品測(cè)定濃度大于測(cè)定方法的靈敏度一百倍以上,測(cè)定才有意義。譬如Schlieren光路對(duì)該樣品測(cè)定靈敏度為0.1mg/ml,那么該樣品測(cè)純度時(shí)的濃度應(yīng)該是90mg/ml。假如選用樣1mg/ml濃度測(cè)定,沉降圖形即使表現(xiàn)單一峰,仍不能確定其純度是0%還是99%。如果樣品是多組分的,離心圖中表現(xiàn)幾個(gè)峰,根據(jù)每個(gè)峰的面積與所有峰的總面積的比值可以得到每個(gè)組分的相對(duì)濃度值。在計(jì)算時(shí)應(yīng)該考慮輻射稀釋效應(yīng),即把各個(gè)組分的面積值根據(jù)其所在位置用輻射稀釋公式校正到液面處的值,然后計(jì)算相對(duì)。還要注意這樣的濃度估測(cè)是建立在各個(gè)組分具有相同的折射率比值的假設(shè)基礎(chǔ)上的。根據(jù)峰形面積結(jié)合該組分的濃度與折射率比值和儀器常數(shù)還可以計(jì)算該組掃的濃度值。
5、帶狀沉降法
帶狀沉降法類似于速率區(qū)帶離心法。方法使用合成界面池,在池中預(yù)先加入0.55ml的1M NaCl溶液,然后地2000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速下鋪上0.01ml樣品液,然后加速到30000轉(zhuǎn)/分,用吸收光路記錄樣品沉降圖形。由于NaNl向樣,品帶擴(kuò)散形成一密度梯度區(qū),可以穩(wěn)
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