摘要：用超臨界C02萃取技術(shù)，設(shè)計(jì)了4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)，研究從海南催吐蘿芙木中提取利血平生物堿的*工藝。*提取條件為：萃取壓力35MPa，萃取溫度60℃，夾帶劑為100g樣品用25mL乙醇，萃取時(shí)間2h。用液相色譜法對(duì)萃取產(chǎn)物中的利血平含量進(jìn)行了測(cè)定。將萃取所得產(chǎn)物用硅膠柱色譜進(jìn)一步分離提純，得到了質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.8％的利血平針狀結(jié)晶。

    關(guān)鍵詞：超臨界CO2萃??；柱色譜；利血平

    傳統(tǒng)中國(guó)藥用植物蘿芙木為夾竹桃科蘿芙木屬多種植物的干燥根及莖，具有清風(fēng)熱，降肝火，消腫解毒的功效，可用于治療感冒發(fā)熱、咽喉腫痛及蛇傷、跌打損傷等癥。蘿芙木的主要活性物質(zhì)是利血平等生物堿類化合物。催吐蘿芙木是引栽品種，已經(jīng)在我國(guó)南方地區(qū)大量引栽種植，海南也有大面積種植，且有文獻(xiàn)證明其利血平含量高于我國(guó)原產(chǎn)蘿芙木。目前蘿芙木生物堿提取方法主要是酸水提取法和有機(jī)溶劑提取法，但這些方法存在提取率低、藥用有效成分含量低、有機(jī)溶劑殘留等缺點(diǎn)。超臨界萃取技術(shù)是一項(xiàng)集提取、分離、濃縮為一體的新技術(shù)，具有工藝過程簡(jiǎn)單，萃取溫度低，選擇性強(qiáng)，無溶劑殘留，不破壞物質(zhì)活性等顯著優(yōu)勢(shì)，在醫(yī)藥及化工行業(yè)中得到了越來越廣泛的應(yīng)用。

    本實(shí)驗(yàn)將超臨界C02萃取技術(shù)與柱色譜分離技術(shù)結(jié)合，用于從海南催吐蘿芙木中提取分離利血平生物堿，通過設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)研究*萃取條件，柱色譜進(jìn)一步分離純制利血平。

    1實(shí)驗(yàn)部分

    1.1儀器與材料

    Spe—edSPE型超臨界流體萃取儀（美國(guó)ASl）；Prostar液相色譜儀，配有紫外檢測(cè)器（美國(guó)Varian）；laborota旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)heidolph）；EsquireHCT質(zhì)譜儀（美國(guó)Bruker）；400MHz核磁共振波譜儀（瑞士Bruker）。

    催吐蘿芙木藥材（采自海南）；液體CO2（佛山科的氣體公司）；利血平對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；柱色譜硅膠和薄層色譜硅膠G（青島海洋化工廠）；色譜純正己烷（美國(guó)TEDIA）；甲醇、氯仿、丙酮（均為廣州化學(xué)試劑廠AR）。

    1.2方法

    1.2.1超臨界CO2萃取

    本文選取對(duì)超臨界流體萃取效率有較大影響的4個(gè)因素：萃取壓力、萃取溫度、萃取時(shí)間、夾帶劑用量，用正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化考察，各因素各取3個(gè)水平，按正交表1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    稱取粉碎后的催吐蘿芙木根粉末200g，裝入萃取釜中，在一定溫度和壓力下進(jìn)行超臨界CO2提取，乙醇為夾帶劑，萃取完畢，收集萃取物，備用。

    1.2.2利血平測(cè)定方法

    （1）色譜條件

    美國(guó)VarianProstar液相色譜儀；手動(dòng)進(jìn)樣器；色譜柱：u—BondpakC183.9mm×l00mm不銹鋼柱；流動(dòng)相為V（甲醇）：V（水）=75:25；流速:1.5ml/min；檢測(cè)器：UV；波長(zhǎng):254mm；外標(biāo)法定量。

    2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

    精密稱取利血平對(duì)照品5mg，置100mL量瓶中，加氯仿稀釋至刻度，搖勻，分別精密移取1、2、3、4、5mL于10mL容量瓶中，加氯仿稀釋至刻度，搖勻，在254nm處測(cè)定吸光度，以吸光度與利血平質(zhì)量濃度回歸，得回歸方程：Y=-0.0016+25.093X（R=0.9996），線性范圍為0.5～15mg／L-1。

    （3）樣品分析方法

    收集不同條件下所得萃取產(chǎn)物，減壓回收夾帶劑，得浸膏，稱取萃取物10mg于100mL容量瓶中，流動(dòng)相溶解并定容至刻度，得樣品溶液。微孔濾膜（0.45μm）過濾后測(cè)定利血平的含量。

    （4）回收率實(shí)驗(yàn)

    稱取樣品6份，置100mL容量瓶中，分別精密加入利血平對(duì)照品溶液，加氯仿稀釋至刻度，搖勻。按上述色譜條件測(cè)定，平均回收率為99.01％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.51%。

    1.2.3放大實(shí)驗(yàn)

    取2kg粉碎的催吐蘿芙木根粉，在1L萃取釜中進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)，萃取壓力為35MPa，萃取溫度為50℃，夾帶劑為每100g樣品用25mL乙醇，萃取時(shí)間2h，收集萃取產(chǎn)物。

    取萃取產(chǎn)物18g與適量硅膠拌勻，加入硅膠柱中不斷洗脫，分段收集洗脫液，同時(shí)進(jìn)行薄層色譜檢測(cè)，合并組分相同的餾分。減壓濃縮，并用甲醇進(jìn)行重結(jié)晶，過濾后再用丙酮洗至白色，放置過夜，得針狀白色結(jié)晶。

    2結(jié)果與討論

    2.1正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

    根據(jù)選定的L9（34）正交表安排實(shí)驗(yàn)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行極差分析，可以看出，各因素對(duì)催吐蘿芙木中利血平提取率的影響程度依次為A>D>B>C，*的萃取方案是A3D2B3C2，即:萃取壓力35MPa，萃取溫度60℃，夾帶劑為每100g樣品用25mL乙醇，萃取時(shí)間2h。

    2.2*工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

    取200g粉碎的催吐蘿芙木根粉按*工藝條件A3D2B3C2進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得利血平的提取率為0.0920％，大于正交實(shí)驗(yàn)的zui大值，說明優(yōu)化是成功的。

    2.3分離產(chǎn)物測(cè)試分析

    所得晶體為白色針狀結(jié)晶，無臭無味，遇光色漸變深。易溶于氯仿，微溶于丙酮、甲醇等有機(jī)溶劑。用薄層色譜檢測(cè)，與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，斑點(diǎn)位置重合。

    核磁共振波譜有下列各特征吸收峰HNMR（CDCl3,TMS內(nèi)標(biāo)），δ:1.82（1H，ddd，H-14α），1.91（1H，ddd，H-20），1.98（1H，ddd，H-19β），2.05（1H，dddd，H-15），2.32（1H，d，H-14β），2.35（1H，ddd，H—19β），2.48（1H，dd，H-21β），2.69（1H，dd，H-16），2.96（1H，ddd，H-6α），3.06（1H，dd，H-21β），3.19（1H，d，H-5β），3.92（1H，dd，H-17），4.51（1H，dd，H-3），5.05（1H，ddd，H-18），6.77（1H，d，H-10），7.32（1H，d，H-9），3.92（3H，s，OCH3），3.83（3H，s，OCH3），3.50（3H，s，OCH3），7.32（2H，s，H—27*2），7.61（1H，brs，N-H）。
    APCI-MS：m／Z=609（M+）。

    上述理化數(shù)據(jù)均與利血平對(duì)照品一致。

    3結(jié)論

    超臨界C02從海南催吐蘿芙木中提取生物堿的過程中，夾帶劑的加入可大大改善萃取效果。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超臨界C02萃取催吐蘿芙木生物堿的*工藝條件為：萃取壓力為35MPa，萃取溫度為60℃，夾帶劑為每100g樣品用25mL乙醇，萃取時(shí)間2h。

    超臨界CO2萃取雖然能在一定程度上將萃取所得產(chǎn)物中的有效成分分離出來，但所含雜質(zhì)仍然較多。本研究通過進(jìn)一步的柱色譜分離，可將不同

    成分依次分離出來，并可制備出質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.8％的利血平結(jié)晶，測(cè)試結(jié)果與對(duì)照品一致。

    利血平為單萜吲哚類生物堿，具有生物活性，見光或受熱易分解，超臨界C02萃取可實(shí)現(xiàn)低溫操作，且整個(gè)提取分離過程在暗場(chǎng)中進(jìn)行，從而能夠使其活性不被破壞，比傳統(tǒng)的提取工藝更*。結(jié)晶純化過程中使用丙酮、甲醇為溶劑，取得了滿意的結(jié)果。