生物制劑包括細(xì)胞團(tuán)子、重組蛋白質(zhì)藥物、抗體、疫苗和寡核苷酸藥物等，其劑型多為注射劑，因此對其進(jìn)行熱原控制非常關(guān)鍵。在生產(chǎn)過程中，表達(dá)系統(tǒng)、原輔材料、生產(chǎn)環(huán)境以及個(gè)人操作等諸多因素都可能造成產(chǎn)品內(nèi)毒素污染。對于生物技術(shù)藥物內(nèi)毒素污染的預(yù)防與去除應(yīng)從兩個(gè)層面考慮：一是在生產(chǎn)過程中，嚴(yán)格按GMP要求進(jìn)行生產(chǎn)，并將目標(biāo)蛋白的純化與內(nèi)毒素的去除結(jié)合起來；一旦產(chǎn)品出現(xiàn)內(nèi)毒素污染，則要針對具體情況選擇不同措施來去除內(nèi)毒素。

    ■注重生產(chǎn)各環(huán)節(jié) 防止內(nèi)毒素污染

    在注射用生物制劑的生產(chǎn)過程中防止內(nèi)毒素污染，涉及生產(chǎn)設(shè)備、過濾介質(zhì)、生產(chǎn)器具、廠房等諸多因素。如在精制純化中，生產(chǎn)車間必須是符合GMP要求的潔凈廠房，各種不同的操作要在不同的潔凈區(qū)內(nèi)分別進(jìn)行。發(fā)酵和粗純應(yīng)該在十萬級潔凈區(qū)進(jìn)行，精純在萬級潔凈區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，制劑、分裝須在百級間或?qū)恿髡窒逻M(jìn)行。對于任何非封閉系統(tǒng)的操作，均應(yīng)采取無菌操作方式，如果系統(tǒng)自動(dòng)化程度較高，可遙控操作或較少手工操作。對于任何直接接觸制品的溶液、容器、生產(chǎn)用具、管路、生產(chǎn)系統(tǒng)等，必須進(jìn)行嚴(yán)格、有效的處理，以去除熱原。另外，用蒸餾法或反滲透法制備的新鮮注射用水或滅菌注射用水必須是無熱原的，這是清洗器具及配制溶液的基礎(chǔ)。

    對于玻璃器皿、不銹鋼制品等生產(chǎn)器具，可將其置于180℃下、3～4小時(shí)或250℃下、1～2小時(shí)干烤，以除去熱原。對于橡膠、塑料制品（如膠塞、膠管等用品），可采用0.1摩爾/升的鹽酸煮沸30分鐘，或用0.1摩爾/升的氫氧化鈉浸泡4小時(shí)以上，急用時(shí)可煮沸30分鐘，然后用新鮮用水沖洗凈，再進(jìn)行高壓滅菌。另外，對于注射型生物制劑的某些關(guān)鍵生產(chǎn)步驟，可采用無菌、無熱原的一次性器具，這樣既可以減少工作步驟，又可防止清洗不凈帶來污染。

    溶液的配制要使用無熱原的新鮮注射用水，整個(gè)過程必須于3小時(shí)內(nèi)完成，并及時(shí)進(jìn)行高壓滅菌。對于一些不能進(jìn)行高壓滅菌的溶液，可通過超濾法除熱原。如磷酸鹽緩沖液在高壓滅菌時(shí)會(huì)產(chǎn)生具有紫外吸收的焦磷酸，這樣在使用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行柱層析時(shí)，就會(huì)對層析圖譜造成干擾，在干擾素的生產(chǎn)與檢定中就曾經(jīng)出現(xiàn)過這樣的情況，對此采用超濾膜可有效地去除溶液中的熱原。

    在注射用生物制劑的生產(chǎn)中，對于系統(tǒng)、管路的清洗涉及原位清洗/原位殺菌（CIP/SIP），即主要針對泵、管道、閥門、濾器、柱、各種罐等進(jìn)行定期清洗殺菌，常規(guī)要求在不拆卸任何組件的情況下原位進(jìn)行。例如對于生物制劑生產(chǎn)中zui普遍使用的單元操作——層析，原位清洗/原位殺菌十分重要。有效的原位清洗可以減少產(chǎn)品污染、維持柱效和提高介質(zhì)壽命。由于新一代的凝膠具有較高的物理化學(xué)穩(wěn)定性，可以使用較高濃度的氫氧化鈉進(jìn)行原位清洗。對于離子交換或疏水層析介質(zhì)（如CM-SepharoseFF），可使用1摩爾/升的氫氧化鈉反向清洗一個(gè)柱床體積，如果每使用3次介質(zhì)清洗1次，可使介質(zhì)使用壽命達(dá)1000次；對于凝膠過濾介質(zhì)（如Sephacry1等），可使用0.5摩爾/升的氫氧化鈉清洗半個(gè)柱床體積，接觸1～2小時(shí)，如果每使用5次介質(zhì)對其清洗1次，可使介質(zhì)使用壽命達(dá)到800次。在白蛋白的純化流程中，對SephadexG-25C的原位清洗可采用0.5摩爾/升的氫氧化鈉清洗0.2個(gè)柱床體積，每使用4次清洗1次，介質(zhì)使用壽命可達(dá)7200次。

    ■設(shè)計(jì)純化工藝去除內(nèi)毒素

    生物制劑的純化手段主要有各種柱層析技術(shù)，如疏水層析、離子交換、親和層析、分子篩等，這些技術(shù)在純化目標(biāo)產(chǎn)品的同時(shí)還可以有效去除內(nèi)毒素。如由于內(nèi)毒素的脂肪A部分有很強(qiáng)的疏水性，但在高鹽下會(huì)凝集，無法掛上疏水層析柱，因此可選擇能結(jié)合目標(biāo)蛋白的疏水層析介質(zhì)來去除內(nèi)毒素。

    離子交換法是通過帶電的溶質(zhì)分子與離子交換劑中可交換的離子進(jìn)行交換而達(dá)到分離純化的方法。由于內(nèi)毒素在pH值＞2時(shí)帶負(fù)電荷，與陰離子交換介質(zhì)Q或DEAESepharoseFastFlow有較強(qiáng)結(jié)合，因此可在洗脫目標(biāo)蛋白后用高鹽緩沖液或氫氧化鈉去除，這是離子交換法去除內(nèi)毒素的基礎(chǔ)。目前美國Pharmacia公司開發(fā)出利用離子交換層析法從白蛋白中去除內(nèi)毒素的工藝，其主要采用DEAE Sep-haroseFastFlow介質(zhì)，將被內(nèi)毒素污染的白蛋白上柱，白蛋白和大部分內(nèi)毒素結(jié)合于介質(zhì)上后，先清洗掉不結(jié)合的內(nèi)毒素，然后選擇性洗脫白蛋白，而90％的內(nèi)毒素仍結(jié)合在柱上，zui后用氫氧化鈉將柱清洗干凈。此種方法每批可以處理20千克內(nèi)毒素含量達(dá)20納克/毫升的白蛋白。

    親和層析技術(shù)特別是免疫吸附劑在生產(chǎn)中的運(yùn)用使得生物大分子的純化變得簡單。免疫吸附的原理基于抗原、抗體的特異性作用，以目標(biāo)蛋白作為抗原，將通過雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)的單克隆抗體偶聯(lián)于介質(zhì)上，以此介質(zhì)來吸附目標(biāo)蛋白。由于相互作用的高度特異性，理論上僅有目標(biāo)蛋白吸附于介質(zhì)上，內(nèi)毒素全部穿透，洗脫后將得到純度很高的無熱原產(chǎn)品。但實(shí)際上，由于介質(zhì)本身存在非特異性吸附，仍有少量的雜蛋白和內(nèi)毒素同時(shí)被吸附，而內(nèi)毒素含量是極低的。在干擾素的生產(chǎn)中，洗脫物內(nèi)毒素含量一般為0.25單位/毫升。

    分子篩是利用凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)根據(jù)分子大小進(jìn)行分離的一種方法。一般重組產(chǎn)品分子量為幾萬道爾頓，而內(nèi)毒素分子量為幾十萬至上百萬道爾頓，常是多聚體，因此利用分子篩可以有效去除內(nèi)毒素。但其處理量小，處理時(shí)間較長。

    ■采用親和層析處理內(nèi)毒素污染

    即使在生產(chǎn)中采取了有效的工藝和嚴(yán)格的預(yù)防措施，原液仍有可能被污染。如何處理已被污染的原液是比較棘手的問題。因?yàn)樵褐型ǔＲ鸭尤氡Ｗo(hù)劑，重新純化是非常困難的。如果原液及保護(hù)劑的分子量與內(nèi)毒素分子量差別較大，理論上可選用適當(dāng)?shù)某瑸V膜來去除內(nèi)毒素，但由于膜吸附過程中有產(chǎn)熱及系統(tǒng)殘留等問題，產(chǎn)品活性損失較大。

    目前被認(rèn)為較為有效的處理方法是采用親和層析技術(shù)，將內(nèi)毒素底物L(fēng)AL或多糖菌素B（PMB）偶聯(lián)于CNBr-Sepharose或NHS-Sepharose上，以此為介質(zhì)特異性吸附內(nèi)毒素，而讓蛋白通過。國內(nèi)一些企業(yè)曾使用美國Sterogene生物分離公司的ACTICLEANETOX凝膠。該產(chǎn)品zui大內(nèi)毒素結(jié)合量為血清中2000單位/毫升膠，水中2000單位/毫升膠。一些企業(yè)使用此凝膠處理被污染的含白蛋白的干擾素，吸附量達(dá)1700單位/毫升膠，去除內(nèi)毒素效果較好，但產(chǎn)品活性有一定損失。該產(chǎn)品的另一優(yōu)點(diǎn)是化學(xué)穩(wěn)定性高，可用1摩爾/升的氫氧化鈉清洗2～14小時(shí)，但其壽命僅1年左右。

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