Elisa實驗：加酶標(biāo)抗體操作

　　以下是ELISA實驗中?加酶標(biāo)抗體?操作的詳細(xì)步驟及注意事項，綜合整理自實驗指南：

　　一、操作步驟

　　抗體稀釋?

　　使用封閉液(如5% BSA或脫脂奶粉)稀釋酶標(biāo)抗體至工作濃度(通常1:1000~1:50000)。

　　稀釋后需充分混勻，避免氣泡產(chǎn)生。

　　加樣與孵育?

　　每孔加入100 μL稀釋后的酶標(biāo)抗體，避免觸碰孔壁或產(chǎn)生氣泡。

　　37℃孵育30-60分鐘(時間根據(jù)說明書調(diào)整)。

　　洗滌?

　　棄去孔內(nèi)液體，用PBST(含0.05% Tween-20的PBS)洗滌3-5次，每次浸泡1-2分鐘并拍干。

　　手工洗板時需垂直拍板，避免交叉污染。

　　二、關(guān)鍵注意事項

　　抗體選擇?

　　夾心法：需確保酶標(biāo)抗體與包被抗體靶向抗原的不同表位，避免競爭結(jié)合。

　　間接法：酶標(biāo)二抗需與一抗種屬匹配(如兔抗鼠IgG-HRP)。

　　質(zhì)量控制?

　　設(shè)置空白對照(僅加稀釋液)和陰性對照(非特異性抗體)，排除背景干擾。

　　顯色后若整板OD值偏低，需檢查酶標(biāo)抗體活性或稀釋比例。

　　其他要點?

　　酶標(biāo)抗體需避光保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。

　　競爭法中，酶標(biāo)抗原與待測抗原需同步加入。

　　三、常見問題處理

　　非特異性結(jié)合?：增加封閉時間(2小時以上)或更換封閉液(如5%脫脂奶粉)。

　　復(fù)孔差異大?：檢查移液器校準(zhǔn)及操作一致性。

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